高致病性禽流感病毒H5N1安徽株A/Anhui/1/2005感染人肺癌上皮细胞（A549）的差异表达分析

论文摘要

A型流感病毒属于正粘病毒科,是一类有包膜,基因组分节段的单链、负链RNA病毒。根据病毒颗粒表面的糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异又可分为不同亚型。迄今,甲型流感病毒HA有16个亚型（H1～H16）,NA有9个亚型（N1～N9）,各种亚型均可在禽类中存在,感染人类的主要是H1和H3亚型。流感病毒基因组的特点,决定了其不断发生抗原漂移和抗原转换,使得新的流行株不断出现。1997年开始出现感染人的H5N1亚型高致病性禽流感病毒。随后,在世界各地又不断出现H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染人的报道,其病死率超过60%。由于高致病性禽流感病毒不断的发生变异,宿主范围扩大,致病性增强,使得对H5N1病毒的预防控制在公共卫生体系中的意义日益凸现。研究H5N1亚型高致病性禽流感病毒的致病机理对于病毒感染防治具有重大的意义,这成为全球科学家的共同任务。本课题选择中国大陆分离的人H5N1亚型高致病禽流感病毒安徽株感染人肺癌上皮细胞（A549）,分析感染前后的差异表达,研究病毒感染对细胞凋亡方面的影响,从而初步阐明人H5N1亚型高致病禽流感病毒安徽株的致病机理。本论文的内容包括三个部分:1.利用人全基因表达芯片对感染人H5N1亚型禽流感病毒的人肺癌上皮细胞进行全基因表达扫描。2.对芯片扫描数据进行整理分析,得到高致病性禽流感病毒感染细胞的差异表达谱,并筛选可能与高致病性禽流感病毒感染致病相关的候选基因。3.通过定量Real-time PCR技术验证候选基因的差异表达。1.人H5N1亚型禽流感病毒感染A549细胞的基因芯片扫描高致病性禽流感H5N1病毒感染A549细胞后,在4h、24h分别收获并裂解感染后的细胞,同时以未感染病毒的细胞为对照。提取细胞裂解的总RNA,反转录合成cDNA第一链后,再合成cDNA第二链并转录合成cRNA,将cRNA片断化后标记生物素,与芯片探针进行杂交并进行荧光信号扫描。收获芯片扫描后的荧光数据。2.芯片扫描数据的整理分析,筛选可能与高致病性禽流感病毒感染致病相关的候选基因通过计算机软件Acuity 4.0将扫描的杂交荧光数值进行标准化处理。并计算每个基因在不同时段的表达变化倍数,同时进行方差分析（ANOVA）。根据倍数变化的大小以及p值,将基因分至4个不同的数据集中。对数据集Ⅰ中的238个基因进行K-mean聚类分析和Gene Ontology分析,并对筛选出的凋亡抑制蛋白基因BIRC3进行了差异表达验证。发现感染人H5N1亚型病毒的细胞比较感染人H1N1亚型病毒的细胞和正常对照细胞中的BIRC3表达具有明显的降低。对数据集Ⅲ～Ⅳ中的基因进行Gene Ontology分析并进行倍数筛选,发现细胞凋亡通路和细胞mTOR通路中的基因有差异表达,将这两条细胞通路以及与免疫相关的16个基因设为候选基因。3.定量Real-time PCR技术验证候选基因的差异表达。按照候选基因的序列,分别设计扩增片断的引物,并保证扩增片断的长度在70～300bp之间。按照定量Real-time PCR试剂盒的操作说明,对16个候选基因的表达进行验证,得到16个基因在细胞感染不同病毒后的不同时段基因的表达差异倍数,并同H1N1感染细胞中的基因表达进行比较。其中,在感染H5N1后4h,与正常细胞相比有6个基因表达升高,6个基因表达下降;和H1N1感染细胞相比,有12个基因表达升高,1个基因表达降低。通过本研究,我们得到了高致病性禽流感病毒H5N1感染人肺癌上皮细胞的基因表达谱,发现并验证了细胞凋亡通路、mTOR通路以及细胞免疫相关的16个基因的差异表达,初步确定了人H5N1亚型流感病毒比人H1N1亚型流感病毒在促进细胞凋亡方面具有更强的作用。这一结论与临床上H5N1病毒感染后病人肺泡上皮细胞损伤的研究结果是一致的,也为阐明高致病性禽流感病毒的致病机理提供了一定的理论依据。

论文目录

• 主要英文缩写词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 一. 人全基因表达谱芯片扫描
• 1. 杂交样品准备
• 二. 芯片数据分析
• 1. 表达谱数据差异表达基因的筛选
• 2. 差异表达基因的基因组定位分析
• 3. 芯片差异表达数据集的聚类分析
• 4. 候选基因的筛选
• 三. 差异表达基因的Real-time PCR验证
• 1. 扩增引物的验证
• 2. Real-time PCR验证
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢