中国明对虾和文蛤EST分析及细胞黏附蛋白基因的克隆和表达谱

论文题目: 中国明对虾和文蛤EST分析及细胞黏附蛋白基因的克隆和表达谱

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 董波

导师: 相建海

关键词: 中国明对虾,文蛤,生物信息学平台,分析,细胞黏附蛋白

文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 海洋生物基因组学和蛋白质组学研究日益迅猛发展,急需引进生物信息学的方法和手段来阐释获得的海量数据,破解蕴藏其中的生物学信息,为实验研究提供信息提示。本论文构建了一套基于 Linux 操作系统的集群计算机环境和 J2EE 分布式运算技术的生物信息学数据分析平台-BLC(Bioinformatics Linux Cluster)系统。这一系统包括 Blast、Pfam、Phrap、Interpro 等生物信息学软件,可以方便地对分子序列数据进行注释、分析和运算。在此基础上,整合课题组已有序列资源,组建了中国经济类海洋生物基因组网站。为了筛选中国明对虾和文蛤中同免疫和生长发育相关的功能基因,从已构建的中国明对虾血液、眼柄和卵巢组织 cDNA 文库中分别测定了 2371 条、1024 条和1172 条 EST。并构建了文蛤幼虫不同发育阶段的 cDNA 文库,从文蛤壳顶期幼虫cDNA 文库中测定了 1060 条 EST 序列。利用本研究构建的生物信息学平台对获得的对虾、文蛤 EST 进行了分析、比较和注释。并从中国明对虾血液 cDNA 文库获得的 971 个 unique 基因中,发现了 112 个同免疫相关的新基因。进一步筛选共确定了在对虾免疫体系中起重要作用的抗菌肽、凝结蛋白、细胞间信号传导、伴侣蛋白和酚氧化酶系统 5 大类共 39 个 unique 基因。在文蛤壳顶期幼虫的 576 个unique 基因中,发现了包括生长结构基因、代谢酶类、免疫相关基因、调控基因等 150 个同生长发育相关的重要功能基因序列提示。利用部分上述生物信息分析结果,克隆获得了一条 2370 bp 的中国明对虾细胞黏附蛋白基因全长 cDNA 序列,共编码 684 个氨基酸,成熟肽理论 pI 为 7.98,分子量为 74.58 KDa,属阳离子多肽。该序列具有 1 个过氧化物酶功能域(domain)和一个整合素结合基序(motif),据此推测该基因具有过氧化酶活性和细胞黏附功能。运用实时定量 PCR 方法分析了灭活的革兰氏阳性菌和阴性菌混合液刺激对虾后细胞黏附蛋白基因的表达谱,结果表明其主要储存在血细胞中,呈组成性表达,是对虾重要免疫应答因子之一,在免疫防御过程中具有重要生理功能。

论文目录:

第一章：引言

第一节：生物信息学在海洋生物学研究中的前景与展望

一、生物信息学的产生背景

二、生物信息学的定义和主要研究内容

1、生物信息的收集、存储、管理与提供

2、基因组序列信息的提取和分析

3、功能基因组相关信息分析

4、生物大分子结构模拟和药物设计

5、生物信息分析的技术与方法研究

6、应用与发展研究

三、国外生物信息学发展趋势与国内发展现状

四、我国开展海洋生物信息学研究的必要性和迫切性

五、构建我国海洋生物信息学分析平台的建议和展望

1、建立我国重要海水养殖生物的核酸和蛋白质数据库

2、开展EST 数据分析和应用研究

3、借助生物信息学深入进行海洋生物功能基因组学研究

4、开展海洋生物基因组的比较与分子进化和系统发育研究

第二节：虾贝类序列表达标签（ESTs）测定及分析概况

一、对虾EST 测序及分析情况

1、中国明对虾EST 分析概况

2、凡纳滨对虾和白滨对虾

3、斑节对虾

4、日本囊对虾

二、贝类ESTs 测序和分析工作

1、牡蛎

2、扇贝

第三节：虾贝类免疫基因研究概况及应用前景

一、对虾养殖业的现状

二、对虾病害发生及控制策略

三、国内外对虾免疫基因研究现状

四、对虾免疫功能基因应用的途径及前景

第四节细胞黏附蛋白的研究概况

第五节本论文研究的目的意义

第二章生物信息学分析平台及海洋生物基因组网站的构建

第一节 BLC 生物信息学分析平台的构建

一、BLC 系统安装的软硬件需求

1、硬件需求

2、软件需求

二、软件安装

1、 Linux 操作系统的安装

2、 JDK1.4 的安装

3、 BLC2003 SERVER 的安装

4、生物信息学分析软件的安装

5、安装PERL

6、安装GD 库

三、BLC 系统配置与试运行

1、主控服务器的初始化

2、运行终端的初始化

3、试运行BLC 系统应用

4、终端的运行

5、通过网络访问BLC 系统

四、BLC 系统应用软件介绍

1、 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

2、 Sim4

3、 PHRAP

4、 PHRED

5、 PROSPECT

6、 INTERPRO

7、 PFAM

8、 CROSSMATCH

第二节中国经济类海洋生物基因组网站

一、系统架构及基本配置

二、页面内容

第三章文蛤幼虫不同发育时期cDNA 文库的构建

一、实验材料与方法

1、不同发育时期幼虫样品的收集

2、总RNA 提取

3、mRNA 的分离

4、后续其它步骤

二、结果与分析

1、total RNA 质量鉴定

2、mRNA 分离

3、一链，二链合成

4、胶回收

5、菌落PCR 鉴定

三、讨论

第四章中国明对虾和文蛤表达序列标签（ESTs）的生物信息学分析

第一节中国明对虾血液、眼柄和卵巢EST 序列分析与比较

一、实验方法

1、序列处理

2、序列分析和注释

二、结果与分析

1、序列测定结果

2、序列比对结果

3、已知基因的功能分类

三、讨论

1、 EST 序列和分析

2、不同组织EST 的比较分析

第二节中国明对虾血液EST 库中免疫相关基因的发现与分析

一、实验材料与方法

1、数据资源

2、分析平台及相应软件

二、结果与分析

三、讨论

1、抗菌肽类

2、凝结蛋白类

3、细胞间信号传导类

4、伴侣蛋白类

5、酚氧化酶激活系统

第三节文蛤壳顶期幼虫EST 数据库的分析

一、实验材料与方法

二、结果与分析

1、序列测定结果

2、序列比对结果

3、已知基因的功能分类

4、 Pfam 查询结果

5、 Pathway 结果

三、讨论

1、生长和结构相关基因

2、代谢酶类

3、免疫相关基因

4、调控基因

5、其它基因

第五章中国明对虾细胞黏附蛋白cDNA 全长克隆和体内表达规律

第一节中国明对虾细胞黏附蛋白cDNA 全长的克隆和序列解析

一、材料与方法

1、实验动物

2、引物序列

3、培养基和试剂的配制

4、血细胞总RNA 的提取和处理

5、第一链cDNA 的合成

6、peroxinectin 片段的克隆

7、3’RACE

8、5’RACE

9、序列分析

二、结果与讨论

1、中国明对虾Peroxinectin 基因全长cDNA 的获得

2、中国明对虾 Peroxinectin 蛋白结构预测

3、细胞黏附蛋白功能域或基序的查找

4、 Peroxinectin 的分子系统进化分析

第二节细菌刺激后中国明对虾细胞黏附蛋白基因的表达谱

一、材料与方法

1、实验动物

2、组织特异性表达的RT-PCR 法测定

3、病原注射实验

4、实时定量PCR

二、结果与讨论

1、对虾细胞黏附蛋白基因的组织表达特异性

2、灭活细菌刺激不同时间对虾细胞黏附蛋白基因的 mRNA 表达变化规律

第六章结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的主要文章目录

致谢

发布时间: 2005-07-05

参考文献

[1].基于凝胶电泳的中国明对虾血浆蛋白质组学研究[D]. 黄冰心.中国科学院研究生院（海洋研究所）2008
[2].对虾抗病毒相关蛋白的分子克隆与功能研究[D]. 王帅.山东大学2010
[3].甲壳动物抗菌肽及信号转导和转录激活因子（STAT）的基因克隆与功能分析[D]. 孙晨.山东大学2011
[4].中国明对虾丝氨酸蛋白酶、活性氧的产生与消除及其半胱氨酸蛋白酶研究[D]. 任乾.山东大学2010
[5].十足目甲壳动物C型凝集素功能研究[D]. 王显伟.山东大学2012

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