论文题目: 玻璃海鞘（Ciona intestinalis）实验养殖、血细胞的分类及其免疫应答研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 刘利平
导师: 相建海
关键词: 玻璃海鞘,人工养殖,血细胞,分类,感染,免疫应答,凋亡
文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 玻璃海鞘属于尾索动物亚门,在进化上处于无脊椎动物向脊椎动物过渡的地位,也是研究无脊椎动物进化免疫学和比较免疫学的最好的实验动物之一。本文报道了玻璃海鞘的人工繁殖和养殖方法,并以之为材料,对玻璃海鞘的血细胞的分类和功能以及感染细菌后血细胞的免疫应答进行了研究,得到以下结果: 将野生玻璃海鞘的受精卵孵化的幼体,采用螺旋藻干粉、虾蟹开口料、鸡蛋黄、叉鞭金藻、食用酵母等多种饵料的组合,经过60d左右的养殖,玻璃海鞘的成活率可达85%,体高平均达59mm且性腺发育成熟。将实验室养殖成熟的玻璃海鞘进行人工授精,得到了发育正常的幼体,从而完成了玻璃海鞘整个生活史的实验室周期养殖。通过细胞化学,细胞酶学,免疫组化,超微结构分析和吞噬实验等方法,将玻璃海鞘的血细胞分为干细胞样血细胞、透明变形细胞、颗粒变形细胞、折光细胞、指环细胞、色素细胞、桑椹细胞和小室细胞。玻璃海鞘的干细胞样血细胞、透明变形细胞、颗粒变形细胞与脊椎动物的造血干细胞、巨嗜细胞、粒细胞在形态和先天性免疫的功能上有一定的相似性,具有脊椎动物淋巴细胞的原始特征。但由于玻璃海鞘没有适应性免疫所必需的基本条件,最终在细胞免疫功能和形式上与脊椎动物存在质的差别。绿色荧光蛋白能在大肠杆菌内稳定表达且荧光不易淬灭,便于观察,是研究细菌感染实验的一种很好的工具。本研究首次以表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌感染玻璃海鞘,发现其总血细胞数量(THC)有明显变化,5min后,血细胞总数下降约36.6%, 3h后下降至最低, 24h后显著升高,至96h恢复到正常水平。参与吞噬大肠杆菌的主要是透明变形细胞,这种吞噬作用在感染5min内即已开始; 透明变形细胞还分泌溶菌酶颗粒黏附到大肠杆菌表面。颗粒变形细胞则分泌大量颗粒,参与体液免疫。干细胞样血细胞表面不见有明显的形态学改变,也不表现吞噬活性。免疫组化结果显示,干细胞样血细胞在注射大肠杆菌后变化显著。注射大肠杆菌后,干细胞样血细胞数量开始升高,在24h达最高,然后开始下降,96h后,干细胞样血细胞恢复到正常水平。同时,在血细胞增长的高峰期,可以见到干细胞样血细胞正进行分裂,表现出明显的增殖功能,这解释了大肠杆菌体内刺激后导致血细胞在12-96h内数量迅速恢复的原因。这也预示玻璃海鞘的血细胞可
论文目录:
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第一章 文献综述
1.1 前言
1.2 玻璃海鞘的分类地位与生物学概述
1.3 玻璃海鞘的研究背景
1.4 玻璃海鞘作为无脊椎动物免疫研究模式的可行性
1.5 免疫与细胞凋亡
1.6 细胞凋亡的判定和研究方法
1.7 本研究的目的与意义
第二章 玻璃海鞘的实验养殖
2.1 材料与方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 玻璃海鞘的实验室养殖
2.1.3 受精卵的获得和孵化
2.1.4 卵细胞滤泡层和支持细胞的去除
2.1.5 人工养殖的玻璃海鞘的胚胎发育和幼体海鞘观察
2.1.6 统计分析
2.2 结果与讨论
2.2.1 不同饵料的饲养效果
2.2.2 不同温度下玻璃海鞘的发育时序和孵化率
2.2.3 胚胎发育
2.2.4 幼体海鞘观察
2.2.5 玻璃海鞘作为模式动物的应用前景
第三章 玻璃海鞘血细胞的分类与功能
3.1 材料与方法
3.1.1 实验动物
3.1.2 血细胞的采集与培养
3.1.3 血细胞的细胞化学分析
3.1.4 细胞酶学分析
3.1.5 免疫组化
3.1.6 嗜菌作用
3.1.7 细胞骨架分析
3.1.8 DAPI 染色
3.1.9 超微结构分析
3.1.10 流式细胞仪分析
3.2 结果
3.2.1 血细胞类型
3.2.2 流式细胞仪分选
3.3 讨论
第四章 玻璃海鞘血细胞感染转EGFP的大肠杆菌的应答反应
4.1 材料与方法
4.1.1 实验动物
4.1.2 转绿色荧光蛋白的大肠杆菌的构建
4.1.3 大肠杆菌的体内注射和体外感染
4.1.4 总血细胞计数
4.1.5 表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌的计数
4.1.6 扫描电镜与透射电镜
4.1.7 免疫组化分析
4.1.8 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察
4.1.9 统计
4.2 结果
4.2.1 注射E.coli 对玻璃海鞘THC的影响
4.2.2 注射后E.coli 在玻璃海鞘血淋巴中的动态变化
4.2.3 玻璃海鞘血细胞感染E.coli 的细胞学变化
4.2.4 注射E.coli对玻璃海鞘CD34~+血细胞的影响
4.3 讨论
第五章 大肠杆菌和鳗弧菌感染引起玻璃海鞘的血细胞凋亡
5.1 材料与方法
5.1.1 实验动物
5.1.2 大肠杆菌和鳗弧菌准备
5.1.3 大肠杆菌和鳗弧菌感染
5.1.4 单细胞凝胶电泳
5.1.5 扫描电镜与透射电镜
5.1.6 TUNEL 原位分析细胞凋亡
5.1.7 激光共聚焦显微镜和荧光显微镜观察
5.1.8 血细胞凋亡的流式细胞仪分析
5.1.9 统计
5.2 结果
5.2.1 单细胞凝胶电泳
5.2.2 电子显微镜结果
5.2.3 TUNEL分析
5.2.4 流式细胞仪检测结果
5.2.5 注射大肠杆菌和鳗弧菌后细胞凋亡的统计
5.3 讨论
主要结果与结论
参考文献
已完成和发表文章
致谢
发布时间: 2006-04-28
参考文献
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