MCPH1过表达对宫颈癌SiHa、CaSKi细胞凋亡的影响

论文摘要

常染色体隐性遗传原发性小头畸形基因MCPH1,也称为BRIT1，在DNA损伤、修复和抑制癌的过程中有重要作用；近年来研究表明其在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。MCPH1在宫颈癌病例中的表达情况尚未见报道，本文主要就MCPH1/BRIT1在宫颈癌中的表达情况及其对宫颈癌SiHa、CaSKi细胞的影响进行初步探索，为今后从基因方向治疗宫颈癌提供了有效依据。研究方法：1.应用SYBR实时荧光定量PCR法检测31例宫颈癌标本及其相对应的宫颈正常组织中MCPH1mRNA的表达情况；运用immunohistochemistry检测MCPH1在宫颈癌标本及其相对应的正常组织中蛋白表达情况。2.根据MCPH1在宫颈癌中的表达情况，本实验组成员袁成福博士构建过表达质粒pcDNA3.1-MCPH1-HA，本人运用双酶切鉴定和测序来鉴定重组质粒pcDNA3.1-MCPH1-HA。3.用脂质体2000瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-MCPH1-HA进入宫颈癌SiHa、CaSKi细胞中。4.分别运用Real-Time PCR、western blot检测MCPH1在宫颈癌SiHa、CaSKi细胞中是否过表达。5.用流式细胞仪检测重组质粒对宫颈癌SiHa、CaSKi细胞的影响。实验结果：1.在31例宫颈癌标本中，MCPH1mRNA的表达，19例癌标本比宫颈正常组织低，1例癌标本比宫颈正常组织高，其余样本无统计学意义；另外6例癌标本比癌旁组织低，1例癌标本比癌旁组织高，其余无统计学意义。2.在31例宫颈癌标本中，MCPH1蛋白的表达结果，采用两样本比较的秩和检验分析数据，P=0.001<0.05，说明宫颈癌及其对应宫颈正常组织两组间MCPH1的表达具有显著差异，由于宫颈癌组的平均秩23.69小于宫颈正常组织组平均秩35.88，故宫颈癌组MCPH1蛋白的表达明显低于宫颈正常组织组。3.重组质粒pcDNA3.1-MCPH1-HA构建成功，经测序鉴定正确。4.将重组质粒瞬时转染进宫颈癌SiHa、 CaSKi细胞，运用Real-Time PCR、免疫印迹检测发现MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显高于阴性对照和正常对照组。5.转染重组质粒的宫颈癌SiHa、CaSKi细胞凋亡率比阴性对照组和正常对照组明显增多。结论：1. MCPH1在宫颈癌中的表达下调。2.成功构建过表达质粒pcDNA3.1-MCPH1-HA，并瞬时转染进入宫颈癌SiHa、CaSKi细胞，发现MCPH1可以诱导宫颈癌SiHa、CaSKi细胞凋亡增加，为进一步研究MCPH1基因在宫颈癌中的作用奠定了一定的基础。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 MCPH1 在宫颈癌标本中的表达检测
• 1 实验材料
• 1.1 宫颈癌标本和引物设计
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液与试剂的配置
• 1.4 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 石蜡切片的制备
• 2.2 组织 RNA 提取
• 2.3 RNA 样品纯度及浓度的测定
• 2.4 RT-PCR 反应
• 2.5 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 宫颈癌标本中 MCPH1 mRNA 检测结果
• 3.2 应用免疫组织化学方法检测 MCPH1 蛋白表达结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 MCPH1 过表达对宫颈癌细胞 SiHa、CaSki 的影响
• 1 实验材料
• 1.1 细胞株和细菌，质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液与试剂的配制
• 1.4 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 细菌的培养和质粒的提取
• 2.2 pcDNA3.1-MCPH1-HA 转染 SiHa、CaSKi 细胞
• 2.3 Real-Time PCR
• 2.4 流式细胞术
• 2.5 蛋白印迹
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 pcDNA3.1 -MCPH1-HA 双酶切鉴定
• 3.2 重组质粒测序鉴定
• 3.3 MCPH1 在宫颈癌 SiHa、CaSki 细胞中表达上调
• 3.4 转染 48h 后细胞状态
• 3.5 MCPH1 对 SiHa、CaSki 细胞的凋亡影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文