猪链球菌两种体内表达蛋白基因的检测及鉴定与该菌LAMP检测方法的建立

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是重要的人兽共患病的病原,能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎等,对养猪业造成巨大的经济损失。根据猪链球菌荚膜多糖抗原性的不同,可将其分为35个血清型（1-34,1/2）,其中以（Streptococcus suis type2,SS2）流行最广、致病性最强。研究发现,并不是所有的SS2都有致病性,菌株致病性强弱与其是否表达毒力相关因子有很大关系。trag、off1616是利用IVIAT（in vivo induced antigen technology）通量筛选鉴定出的SS2感染相关因子,鉴于我国分离株trag.orf1616分别与GenBank公布的SS2北美株89/1591的trag序列有95.8%的同源性,与Sanger研究所公布的SS2P1/7的第1616编码蛋白的基因序列有99.7%的同源性,据此设计和合成了两对检测引物,对SS2我国江苏及四川流行株、其他临床分离株和参考株及SS1、SS1/2、SS9、SS7及C群猪源链球菌共43株进行PCR扩增。结果表明,trag在SS2中94%（30/32）阳性,SS9中67%（4/6）阳性,SS7阳性,SS1、SS1/2及C群阴性;而orf1616在SS2中96.9%（31/32）阳性,SS1/2、SS1、SS7、SS9及C群菌阴性。设计一对可扩增trag完整阅读框的引物,对5株SS代表菌株的核酸进行PCR扩增,产物纯化后测序,软件推导其氨基酸序列后比对,结果表明,5株细菌TRAG的氨基酸序列与SS2中国株98HAH33、05ZYH33及北美株89/1591有很高的同源性（＞97%）。选择TRAG、ORF1616免疫原性良好的区域片段设计表达引物,PCR扩增后定向克隆至表达载体pET28a（+）构建表达质粒,表达蛋白转印到PVDF膜上,分别与SS2猪康复血清和猪高免血清反应。结果表明,所获得重组蛋白只能与康复血清反应,提示TRAG、ORF1616可能与SS2体内感染相关。为了鉴定SS2毒力菌株,根据SS2荚膜多糖合成相关基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、新基因orf1616设计合成两对引物,建立双重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、特异性及敏感性实验。结果显示:31株SS2致病菌株均同时扩增出这2个目的片段,而SS2非致病菌株T15只扩增出cps2J,9株其它血清型猪链球菌（SS1/2、SS1、SS7、SS9）及2株C群猪源链球菌cps2J和orf1616阴性。以SS2ZY05719为模板的双重PCR产物测序结果与GenBank上公布的cps2j（DQ207606）、Drf1616（EF563980）序列完全相同,该PCR敏感极限是400CFU。而赵冉所建立的SS2三重PCR检测方法中,mrp不仅存在于SS2致病菌株,也存在于SS2非致病菌株T15中;orf2不仅存在于SS2中还广泛存在于其他致病性猪源链球菌中且序列保守;而本试验选取cps2J、orf1616建立双重PCR检测方法,不仅特异性强,敏感性好,且orf1616只存在SS2致病菌株中,可用于SS2菌株毒力强弱的快速鉴定,有利于猪链球菌病的监测与控制。首次将环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）应用于SS2的快速检测。针对SS2的荚膜多糖合成相关基因（cps2j）和新基因orf1616分别设计4条特异性引物（两条内引物和两条外引物）进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度分别为63℃、60℃。对5种已鉴定的细菌共47株菌进行LAMP扩增,32株SS2 cps2j得到阳性扩增结果,31株SS2 orf1616得到阳性扩增,结果证明引物具有很高的特异性。SS2基因组的检测灵敏度110fg。因此,该方法检测SS2特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测SS2的有效手段。但应注意检测过程中防止核酸污染,以免造成假阳性结果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪链球菌2型的研究进展
• 第二章 环介导等温扩增技术研究进展
• 第二篇 试验部分
• 第三章 体内表达新基因trag在猪链球菌中的检出及鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 第四章 体内表达新基因orf1616在猪链球菌中的检出及鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 第五章 猪链球菌2型双重PCR检测方法的建立
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 第六章 猪链球菌2型LAMP检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 全文总结
• 致谢