钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的克隆、表达及免疫保护性研究

论文摘要

目的:构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22基因的原核表达载体pQE31-Loa22,并在大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。Loa22蛋白免疫豚鼠,研究其在豚鼠体内产生的的体液免疫和细胞免疫应答水平,并通过体内外试验检测其免疫保护性,为研制钩端螺旋体疫苗奠定实验基础。方法:以赖型钩端螺旋体56601株基因组为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增大小为516 bp的目的基因片段。Loa22基因克隆至原核表达载体,构建pQE31-Loa22。重组质粒双酶切和测序鉴定。重组质粒转化入大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blot鉴定目的蛋白。于0 w、2 w、4 w将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下、背部多处免疫豚鼠。末次免疫后2 w,用培养7d的56601株钩端螺旋体从腹腔攻击各免疫组豚鼠（1mL/只）。连续观察15天,观察各免疫组豚鼠发病情况,并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片,HE染色观察比较各免疫组豚鼠的组织病理变化。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。ELISA法测定各免疫组豚鼠血清中抗体水平。无菌分离豚鼠脾淋巴细胞,MTT比色法检测各免疫组豚鼠脾淋巴细胞的体外增殖反应,计算刺激指数。ELISA测定Loa22蛋白抗血清与致病性钩端螺旋体56607、56603、56609株的交叉免疫反应。通过Fontana镀银染色法检测Loa22蛋白抗血清对钩端螺旋体56601株黏附Raw264.7细胞的阻断情况。结果:PCR扩增出为516bp的目的片段。重组质粒经测序和双酶切鉴定构建成功。重组质粒转化入M15后,SDS-PAGE、Western-blot检测目的基因能表达Mr为22KD的蛋白。豚鼠接种Loa22蛋白后产生了特异性抗体,末次免疫后2 w豚鼠血清抗体最高滴度均达到了1:8000,而接种PBS的豚鼠血清中无特异性抗体。蛋白免疫组豚鼠脾淋巴细胞在体外经蛋白刺激后刺激指数（3.25±0.37）明显高于PBS对照组（1.38±0.13）。Loa22蛋白免疫的豚鼠用56601株钩体攻击,经实验观察无发病现象,HE染色显示各组织没有病理改变。而PBS免疫的豚鼠在实验中不同程度的出现食欲不振、活动减少等现象,HE染色显示各组织均有明显的病理改变。Loa22蛋白抗血清与致病性钩体56607、56603和56609株具有良好的交叉免疫反应（效价为1/409600、1/819200、1/3376800）。Loa22蛋白抗血清稀释比率为1:50时黏附抑制率为90%,稀释比率为1:400时黏附抑制率为50%。结论:（1）成功扩增了Loa22基因,并成功构建了原核表达载体pQE31-Loa22。并在大肠杆菌M15表达出Mr约为22KD的重组蛋白。（2） Loa22蛋白在豚鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答。（3） Loa22蛋白在豚鼠体内诱生的免疫应答能抵抗同型钩体感染。（4） Loa22蛋白抗血清与不同血清型钩体具有交叉免疫反应。（5） Loa22蛋白抗血清能够阻断钩体黏附细胞。

论文目录

• 主要缩略语英文索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 实验材料
• 实验方法及步骤
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 文献综述
• 参考文献
• 研究成果及发表论文
• 致谢