牛孤雌胚胎凋亡与氧化损伤的研究

论文摘要

卵母细胞的孤雌激活对于一系列与卵母细胞及胚胎相关的技术如胞质内精子注射、核移植等非常重要,然而孤雌激活受激活方法、胚胎培养液、培养气相环境等各种因素的制约,卵裂率、囊胚率均较体外受精（IVF）胚胎差,本文就牛孤雌胚胎凋亡与氧化损伤方面展开研究,旨在提高孤雌激活水平,为克隆技术提供技术基础。1.分别用离子霉素（Ion）+6-DMAP与Ion+放线菌酮（CHX）激活牛卵母细胞,用TUNEL法检测孤雌胚胎凋亡发生的起始、频率,以及凋亡细胞的形态学变化。结果显示,虽然Ion+6-DMAP（ID）组的卵裂率较Ion+CHX（IX）组低,但囊胚率显著高于IX组。第5 d首先在IX组检测到TUNEL阳性核,ID组凋亡比IX晚1 d发生。ID组的凋亡率从第6 d开始到第8 d由8%增加到11%,而IX组则由13%增加到19%,可见二者增长幅度很相近。IX组平均囊胚细胞数比ID组显著减少,但凋亡率却比ID组高。结果表明牛孤雌胚胎存在凋亡,但采用Ion联合6-DMAP激活牛卵母细胞,胚胎发育情况相对较好一些。2.在牛卵母细胞成熟液和胚胎培养液中添加β-巯基乙醇（β-ME）,研究β-ME对牛卵母细胞核成熟和孤雌胚胎发育的影响。牛卵母细胞体外成熟液中分别添加0.05,0.1,0.15 mmol/Lβ-ME,检查核成熟率;激活的卵母细胞分别培养在含0.05,0.1,0.15 mmol/Lβ-ME的SOF中,或在1-细胞期、8-16细胞期、桑葚胚期分别添加0.1 mmol/Lβ-ME,第168～192 h检查囊胚发育率。结果表明,β-ME对牛卵母细胞核成熟无显著影响（P﹥0.05）;0.05,0.1 mmol/Lβ-ME可显著提高牛孤雌胚胎卵裂率及囊胚发育水平,而以0.1 mmol/Lβ-ME添加组效果最佳;牛孤雌胚胎发育到8～16细胞期前添加0.1 mmol/Lβ-ME囊胚发育水平显著提高（P﹤0.05）,而1-细胞期组与8～16细胞期组囊胚率、囊胚细胞数差异显著（P﹤0.05）,故1-细胞期是添加β-ME的最佳时机。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 卵母细胞孤雌激活与孤雌胚胎的发育
• 1.1 哺乳动物卵母细胞激活机制
• 2+的动态变化'>1.1.1 激活过程中胞质Ca²⁺的动态变化
• 1.1.2 IP3
• 1.1.3 DAG
• 1.1.4 卵母细胞激活的分子机理
• 1.2 孤雌激活的方法
• 1.2.1 电脉冲
• 1.2.2 乙醇处理
• 1.2.3 钙离子载体A23187
• 1.2.4 Ionomycin
• 1.2.5 CHX
• 2+'>1.2.6 Sr²⁺
• 1.2.7 6-DMAP
• 1.2.8 细胞松弛素B（CCB）
• 1.2.9 精液提取物
• 1.3 孤雌激活卵的核型
• 1.4 影响卵母细胞激活效果的因素
• 1.4.1 激活方法
• 1.4.2 卵龄
• 1.4.3 激活时间
• 1.4.4 电参数
• 第二章 细胞凋亡研究进展
• 2.1 细胞凋亡概述
• 2.1.1 细胞凋亡的形态学变化
• 2.1.2 细胞凋亡的生化特征
• 2.1.3 细胞凋亡与细胞坏死的区别
• 2.1.4 细胞凋亡与PCD 的区别
• 2.2 细胞凋亡的信号转导途径
• 2.2.1 死亡受体介导的凋亡途经
• 2.2.2 线粒体介导的凋亡途经
• 2.3 重要的凋亡调控基因
• 2.3.1 Caspase 家族
• 2.3.2 Bcl-2 基因家族
• 2.3.3 P53 基因家族
• 2.3.4 IAP 家族及其拮抗基因
• 2.4 细胞凋亡的检测方法
• 2.4.1 形态学观察
• 2.4.2 Annexin V 联合PI 法
• 2.4.3 Hoechs-PI 双染色法
• 2.4.4 DNA 片段化检测
• 2.4.5 DNA 片段原位标记法
• 2.4.6 酶联免疫吸附法（ELISA 法）
• 2.4.7 免疫印迹（Immunoblotting）技术
• 2.4.8 流式细胞仪定量分析
• 2.4.9 相关基因mRNA 水平的检测
• 2.4.10 CytC 的定位检测
• 2.4.11 线粒体膜势能的检测
• 2.4.12 细胞内氧化还原状态的检测
• 2.4.13 凋亡相关蛋白TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析
• 2.5 胚胎细胞凋亡
• 2.6 凋亡与疾病
• 第三章 氧化损伤的研究进展
• 3.1 氧化应激概述
• 3.2 ROS 与自由基
• 3.3 自由基来源及抗氧化剂
• 3.4 氧化应激的危害
• 3.5 氧化应激与凋亡
• 3.6 谷胱甘肽抑制氧化损伤的机制
• 3.7 胚胎氧化损伤
• 第四章 不同激活剂对牛孤雌胚胎凋亡的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 卵母细胞的体外成熟
• 4.1.3 卵母细胞的孤雌激活
• 4.1.4 胚胎培养
• 4.1.5 凋亡检测
• 4.1.6 实验设计与数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同激活试剂对牛孤雌胚胎卵裂率、胚胎发育的影响
• 4.2.2 牛孤雌胚胎凋亡的起始与频率
• 4.2.3 牛孤雌胚胎囊胚细胞数与凋亡
• 4.3 讨论
• 第五章 Β-巯基乙醇对牛孤雌胚胎发育的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 牛卵母细胞的体外成熟
• 5.1.3 牛卵母细胞的孤雌激活
• 5.1.4 牛孤雌激活胚胎的培养
• 5.1.5 囊胚细胞计数
• 5.1.6 试验设计与数据分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 β-ME 对牛卵母细胞核成熟的影响
• 5.2.2 β-ME 对牛孤雌胚胎发育的影响
• 5.2.3 不同时期添加β-ME 对牛孤雌胚胎发育的影响
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 附录 试验用其它仪器
• 致谢
• 个人简介