银白杨再生体系建立及rolB-pttGA20ox双价基因遗传转化促进生根和高生长的研究

论文摘要

银白杨（Populus alba）是我国西北地区重要的速生造林树种,其材质优良,抗逆性强,但扦插繁殖不易生根,生长速度也比其他白杨慢,在很大程度上限制了这一优良树种的推广与应用。本研究的主要目标是通过农杆菌介导的遗传转化方法导入rolB-pttGA20ox双价基因,利用基因工程技术开展改良生根性状的转基因研究,从而培育扦插生根能力强、生长快的银白杨新品种。围绕这一目标,本研究以银白杨当年生枝条的带芽茎段为外植体,首先建立了该树种的离体快繁及植株再生体系,并就培养条件和植物生长调节剂等因素对银白杨叶片直接再生体系的影响进行了详细的研究;然后利用NPTⅡ筛选基因对影响根癌农杆菌介导银白杨遗传转化的条件做了深入探索,通过优化转化条件,建立了银白杨遗传转化体系;最后在此基础上,进行rolB-pttGA20ox双价基因的转化,并由PCR、Southern杂交和形态特征差异检测,以证明是否为转化植株。主要研究结果如下:1.茎段再生不定芽体系的建立。消毒的最佳方法为:70%的酒精浸泡30s+1%NaClO灭菌15min～35min。启动培养基最佳组合为MS + 6-BA0.5mg/L +NAA0.1mg/L ,启动率达到了74.1 %。MS + 6-BA1.0mg/L + NAA0.3mg/L +KT0.2mg/L+IBA0.4mg/L为增殖培养的最佳配方,增殖系数可达8.3以上。生根培养的最适培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6g/L,生根率达到100%。移栽炼苗以蛭石作为最佳基质,移栽成活率达90.2%以上。2.叶片再生不定芽的研究。叶片不定芽诱导的最适培养基是MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.5%+琼脂0.55%,pH5.8,不定芽再生率达95%以上;叶片不定芽再生能力强的最佳取材位置是自试管苗顶端向下伸展叶的第13片叶;生根试管植株叶片的不定芽再生能力强于无根试管植株。3.玻璃苗产生机理的研究。与正常苗相比,玻璃苗的叶片和茎段横切面结构发生了很大变化;玻璃苗组织含水量增加;叶绿素含量、可溶性蛋白含量、相对电导率、MDA和RNA含量降低;SOD、CAT活性和DNA含量变化不大;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质进行分析,发现电泳谱带均出现增加、缺失等异常现象。

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 本文缩略词
• 1 引言
• 1.1 本研究的目的和意义
• 1.2 杨树的离体再生及遗传转化系统研究进展
• 1.2.1 影响杨树离体再生的有关因子研究
• 1.2.2 杨树遗传转化系统的研究现状
• 1.2.2.1 遗传转化方法
• 1.2.2.2 影响农杆菌转化效果的主要因素
• 1.3 Ri 质粒及rolB 基因在促进植物生根中的作用及其研究进展
• 1.3.1 发根农杆菌及Ri 质粒
• 1.3.2 rol（rooting locus）基因的发现及功能
• 1.3.3 rolB 基因的作用机理
• 1.3.4 Ri 质粒及rol 基因的应用
• 1.3.4.1 促进植物生根
• 1.3.4.2 改良植物株型
• 1.3.4.3 增强植物抗逆性
• 1.3.4.4 提高植株的生长量和品质
• 1.3.4.5 生产次生代谢物质
• 1.3.4.6 开花诱导和花发育调控研究
• 1.4 赤霉素在促进植物顶端优势中的作用及研究进展
• 1.4.1 赤霉素简介
• 1.4.2 赤霉素促进植物伸长的机理
• 1.4.2.1 GA 促进细胞分裂
• 1.4.2.2 诱导膨胀素的产生或活性增加
• 1.4.2.3 提高木葡聚糖内转葡糖基酶的活性
• 1.4.2.4 促进微管与细胞长轴呈垂直排列
• 1.4.2.5 GA 诱导植物茎基因的表达
• 1.5 研究的主要内容与技术路线
• 2 银白杨高效再生体系的建立及其优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 银白杨组织培养的材料与方法
• 2.1.1.1 接种材料
• 2.1.1.2 外植体的表面灭菌
• 2.1.1.3 启动培养设计方案
• 2.1.1.4 继代增殖培养设计方案
• 2.1.1.5 壮苗培养
• 2.1.1.6 生根实验设计方案
• 2.1.1.7 炼苗及移栽
• 2.1.2 银白杨叶片再生体系建立的材料与方法
• 2.1.2.1 试管植株的获得和接种材料
• 2.1.2.2 最佳植物生长调节剂组合的筛选
• 2.1.2.3 不同材料来源叶片不定芽再生率的比较
• 2.1.2.4 不同着生位置叶片不定芽再生率的比较
• 2.1.2.5 其他因子对叶片不定芽分化的影响
• 2.1.3 银白杨组培苗玻璃化研究的材料与方法
• 2.1.3.1 实验材料
• 2.1.3.2 形态解剖学观察
• 2.1.3.3 各项生理生化指标的测定
• 2.1.4 数据统计与分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 银白杨组织培养结果与分析
• 2.2.1.1 不同灭菌处理对外植体成活率的影响
• 2.2.1.2 启动培养最佳方案的建立
• 2.2.1.3 增殖继代培养
• 2.2.1.4 壮苗培养
• 2.2.1.5 生根培养
• 2.2.2 叶片不定芽再生影响因素的研究
• 2.2.2.1 叶片不定芽诱导最佳植物生长调节剂组合的筛选
• 2.2.2.2 无根与生根试管苗叶片不定芽再生率的比较
• 2.2.2.3 不同取材位置对叶片不定芽再生率的影响
• 2.2.2.4 其他因子对叶片不定芽再生的影响
• 2.2.3 银白杨组培苗玻璃化研究的结果与分析
• 2.2.3.1 玻璃苗与正常试管苗的外表形态结构差异
• 2.2.3.2 解剖结构特点
• 2.2.3.3 玻璃苗在水分、叶绿素及可溶性蛋白、可溶性糖含量上的变化
• 2.2.3.4 玻璃苗与正常苗相对电导率、MDA、SOD、POD、CAT 等生化指标的差异
• 2.2.3.5 试管苗的可溶性蛋白质电泳分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 银白杨外植体的消毒与处理
• 2.3.2 培养基对组培结果的影响
• 2.3.3 植物生长调节剂的影响
• 2.3.4 培养条件对银白杨不定芽增殖的影响
• 2.3.5 生根及炼苗移栽
• 2.3.6 银白杨叶片不定芽再生的影响因素
• 2.3.7 银白杨试管苗玻璃化的机理
• 2.3.8 银白杨试管苗玻璃化的防治
• 3 农杆菌介导的银白杨遗传转化体系的建立与优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物受体材料
• 3.1.2 农杆菌与质粒
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 银白杨转化体系中抗生素浓度实验
• 3.2.1.1 卡那霉素对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.2.1.2 G418 对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.2.1.3 头孢霉素对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.2.1.4 羧苄青霉素对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.2.1.5 不同抗生素对农杆菌抑制效果测定
• 3.2.2 农杆菌的活化培养
• 3.2.3 农杆菌介导的银白杨遗传转化程序
• 3.2.4 影响银白杨转化效果的因素筛选
• 3.2.4.1 预培养时间
• 3.2.4.2 侵染时间和菌液浓度
• 3.2.4.3 共培养时间
• 3.2.4.4 侵染菌液的制备方法
• 3.2.4.5 添加乙酰丁香酮的处理
• 3.2.4.6 延迟选择
• 3.2.5 评价指标
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 银白杨遗传转化中抗生素浓度优化的研究
• 3.3.1.1 卡那霉素对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.3.1.2 G418 对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.3.1.3 头孢霉素对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.3.1.4 羧苄青霉素对银白杨叶片再生、茎段分化及组培苗生根的影响
• 3.3.1.5 羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果
• 3.3.2 银白杨高效遗传转化系统的建立
• 3.3.2.1 预培养时间对银白杨产生抗性芽的影响
• 3.3.2.2 菌液浓度和侵染时间对银白杨产生抗性芽的影响
• 3.3.2.3 共培养时间对银白杨产生抗性芽的影响
• 3.3.2.4 乙酰丁香酮对银白杨遗传转化率的影响
• 3.3.2.5 菌液的制备方法对银白杨遗传转化率的影响
• 3.3.2.6 延迟选择天数对银白杨遗传转化率的影响
• 3.3.2.7 银白杨抗性芽的获得和生根
• 3.4 讨论
• 3.4.1 抗生素种类选择及敏感性测定
• 3.4.2 遗传转化体系的研究
• 3.4.2.1 预培养时间
• 3.4.2.2 共培养对遗传转化的影响
• 3.4.2.3 菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响
• 3.4.2.4 乙酰丁香酮对遗传转化的影响
• 3.4.2.5 延迟选择的时间
• 3.4.2.6 选择培养的选择方法
• 4 转基因银白杨植株的检测与鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 植物材料
• 4.1.1.2 质粒和菌株
• 4.1.1.3 主要实验试剂及仪器
• 4.1.1.4 PCR 扩增所需引物序列
• 4.1.1.5 培养基
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 转基因植株叶片再生的卡那霉素抗性鉴定
• 4.1.2.2 质粒DNA 的提取
• 4.1.2.3 PCR 检测
• 4.1.2.4 Southern-blot 分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 卡那霉素抗性鉴定转基因植株的叶片再生能力
• 4.2.2 转rolB 基因的PCR 检测
• 4.2.3 转rolB-pttGA200x 双价基因的PCR 检测
• 4.2.4 转rolB 基因的Southern 杂交分析
• 4.2.4.1 酶切效果
• 4.2.4.2 杂交效果
• 4.2.5 转rolB-pttGA200x 双价基因的Southern 杂交分析
• 4.2.5.1 酶切效果
• 4.2.5.2 杂交效果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 转化植株叶片再生的卡那霉素抗性鉴定
• 4.3.2 PCR 鉴定
• 4.3.3 Southern blotting 鉴定
• 4.3.3.1 DNA 样品的制备
• 4.3.3.2 电泳、转膜和固定
• 4.3.3.3 预杂交和杂交
• 4.3.4 关于假转化和假阳性植株
• 5 银白杨转基因植株外源基因表达的初步测定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 转基因银白杨的表型性状变异分析
• 5.1.2.2 转基因银白杨的生根能力变异分析
• 5.1.2.3 转基因银白杨的高生长能力变异分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转rolB 基因银白杨的形态变异
• 5.2.2 转rolB-pttGA200x 双价基因银白杨的形态变异
• 5.2.3 转基因银白杨植株的生根时间和生根数量的变化
• 5.2.4 转基因银白杨植株的高生长和节间伸长速度的变化分析
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 图版1 银白杨高效再生体系的建立
• 图版2 银白杨抗生素敏感性实验
• 图版3 银白杨抗性芽的获得和生根
• 图版4 转基因银白杨组培苗比较
• 个人简历
• 导师简介
• 致谢
• 博硕士学位论文同意发表声明