HBsAg基因的克隆及其在毕赤酵母和葡萄组织中的表达

论文摘要

本研究利用PCR扩增出adr亚型乙肝表面抗原（HBsAg）基因,构建了酵母和植物表达载体,通过巴斯德毕赤酵母和葡萄组织对获得的乙肝表面抗原基因进行表达研究,取得了如下进展: 1 通过PCR将本实验室构建的pBI121/HB植物表达载体中的乙肝表面抗原基因扩增出来,构建了克隆载体pUC19HB,通过酶切对克隆载体进行了鉴定和测序,并和NCBI中的基因序列进行Blast,证实所获得的基因序列和登陆号为AY646444.1的乙肝表面抗原基因序列完全一致。结果表明,HBsAg基因已经克隆至pUC19中。为HBsAg基因构建表达载体奠定了基础。 2 将克隆载体pUC19HB和酵母表达载体pPIC3.5K用相同的限制性内切酶切割,回收目的片段,用T4 DNA连接酶将两者连接,筛选得到酵母表达载体,经酶切鉴定HBsAg基因已经正确地连接到pPIC3.5K上。用LiCL法将重组以后的酵母表达载体导入甲醇型酵母（Pichia.pasteoris）菌株GS115中,获得转化子。将转化子进行PCR筛选,得到酵母重组菌株。在以甲醇为唯一碳源的培养基上培养,对重组酵母菌株进行了诱导表达。经过SDS-PAGE,发现在诱导72小时后目的蛋白表达量最大,而且在23kDa和27kDa处均有目的条带,说明Pichiapastoris成功表达了HBsAg蛋白,并进行翻译后加工修饰。对表达的蛋白用ELISA初步定性检测结果为阳性,表明表达的HBsAg具有免疫活性,所获得的HBsAg基因可以用于蛋白表达研究。实验结果为下一步利用该基因转化植物材料提供有力的保证。 3 以植物表达载体pBI121/HB为基础,成功构建了新的植物表达载体pCAMBIA1301/HB。将所构建的植物表达载体转化入农杆菌LBA4404,利用农杆菌LBA4404介导转入葡萄愈伤组织中。 4 利用葡萄（Vitis vinifera Linn.）作为表达HBsAg的受体材料。以葡萄叶片为诱导材料,在附加1mg/LNAA,0.1mg/L6-BANAA的MS培养基中诱

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 一 利用酵母生产疫苗研究进展
• （一） 毕赤酵母表达系统的优点
• （二） 毕赤酵母表达系统的缺点
• 二 转基因植物口服疫苗研究进展
• （一） 利用转基因植物生产蛋白研究进展
• （二） 转基因植物疫苗在人体内免疫反应的途径
• （三） 转基因植物蛋白表达过程中存在的问题
• 1 转基因植物中蛋白表达量
• 2 抗原蛋白在转基因植物中的稳定性
• 3 口服免疫的免疫耐受性及其免疫记忆
• 4 转基因疫苗的安全性
• 三 该研究的目的、意义和内容
• （一） 研究的目的和意义
• （二） 研究内容
• 第二部分 毕赤酵母表达乙肝表面抗原
• 一 实验材料
• （一） 质粒和菌株
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• （四） 基本培养基
• 1 母液
• 2 培养基
• 二 实验方法
• （一） 目的基因获得
• （二） 大肠杆菌（E coli） DH5α感受态的制备
• （三） 质粒 DNA转化大肠杆菌
• （四） 酵母表达载体的构建
• （五） 酵母表达载体的线性化和纯化
• （六） LiCL方法制备酵母GS115感受态细胞及其转化
• 1 主要试剂
• 2 实验步骤
• （七） 毕赤酵母基因组的提取
• （八） 酵母转化子的PCR鉴定
• （九） 重组酵母的诱导表达及其表达蛋白提取
• （十） SDS-PAGE中蛋白银染
• 1 主要试剂
• 2 实验步骤
• （十一） ELISA检测
• 三 结果
• （一） 目的基因的获得及其克隆载体酶切
• （二） 目的基因的测序
• （三） 目的基因翻译序列分析
• （四） 酵母表达载体的酶切鉴定
• （五） 酵母转化子的PCR鉴定结果
• （六） 酵母诱导表达及其SDS-PAGE
• （七） 目的蛋白ELISA检测
• 第三部分 葡萄愈伤组织表达乙肝表面抗原
• 一 试验材料
• （一） 植物材料
• （二） 质粒和菌株
• （三） 主要试剂
• （四） 主要仪器
• （五） 基本培养基
• 二 实验方法
• （一） 植物表达载体构建
• （二） 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• （三） 根癌农杆菌感受态细胞的转化
• （四） 根癌农杆菌质粒提取和鉴定
• （五） 根癌农杆菌的培养
• （六） 葡萄愈伤组织的诱导及预培养
• （七） 葡萄愈伤组织对潮霉素的敏感性试验
• （八） 根癌农杆菌与葡萄愈伤组织的共培养和选择培养
• （九） 用CTAB法提取葡萄愈伤组织总DNA
• 1 主要试剂
• 2 实验步骤
• （十） 抗性愈伤组织 PCR鉴定
• （十一） 抗性愈伤组织 PCR-Southern杂交鉴定
• 1 PCR产物电泳及其变性
• 2 毛细管转移法转膜
• 3 探针制备
• 4 预杂交和杂交
• 5 严谨洗膜
• 6 底物孵育及其曝光
• 7 X光片显影
• 三 实验结果
• （一） 表达载体的构建和酶切鉴定
• （二） 葡萄愈伤组织筛选剂浓度的确立
• （三） 葡萄愈伤组织预培养时间对根癌农杆菌转化的影响
• （四） 甘露醇处理对根癌农杆菌转化的影响
• （五） 抗性葡萄愈伤组织的PCR鉴定结果
• （六） PCR-Southern杂交结果
• 第四部分 讨论
• （一） 关于酵母表达系统
• （二） 毕赤酵母表达蛋白的诱导
• （三） 毕赤酵母表达乙肝表面抗原的修饰
• （四） 关于农杆菌转化植物材料时植物表达载体的选择
• （五） 关于农杆菌转化的几个影响因素
• 1 农杆菌系的侵染能力
• 2 共培养中外界因素的影响
• 3 再生系统
• （六） 关于转基因植物组织的分子生物学鉴定
• 第五部分 小结
• 第六部分 参考文献
• 致谢