SARⅡ-628双胚苗水稻自然同源三倍化后DNA甲基化与基因表达的研究

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近年来，植物多倍体进化与基因表达研究已成为多倍体研究的前沿，取得的主要成果是多倍化后迅速发生了基因表达多态性分化，包括多倍体群体内不同单株间多态性表达与器官特异性表达变化。然而研究主要集中于小麦（Triticum）、棉花（Gossypium）、芸苔（Brassica）等偶数倍的人工异源多倍体，同源多倍体甲基化与基因表达变异研究仅有少数几个例子：如酵母（Saccharomyces cerevisiae）和拟南芥（Arabidopsis）等；自然多倍体中也仅少数几个最近起源的多倍体如大米草（Spartina）、婆罗门参（Tragopogon）和千里光（Senecio），知道并能获得其起源亲本而对其进化与表达有所研究；自然发生的同源三倍体水稻DNA甲基化与基因表达变化研究几乎没有，然而同源多倍体与水稻多倍体都与进化相关，因而同源多倍体与水稻多倍体基因表达与进化的研究也不应该被忽视。本研究中采用双胚苗水稻SARⅡ-628中自然发生的同源三倍体为研究材料，利用同裂酶MspⅠ和HpaⅡ分析了三倍化后甲基化变异；利用基因芯片、cDNA-AFLP与RT-PCR三种方法相结合分析了三倍化后基因表达变化（基因芯片分析中兼顾了单倍化后基因表达变化）。结果表明SARⅡ-628自然同源三倍化后当代甲基化与基因表达都迅速发生了不同程度的变异，取得主要结果如下：一、甲基化变异分析：1)三倍化后甲基化程度变化不大，由17.24％变化为三倍化后的17.20％；2)29个甲基化变异位点中甲基化程度上升、下降与不定的比例分别为29.51％、47.54％和22.95％，甲基化程度下降多于上升；3)甲基化变异遍布于整个基因组且存在位点特异性。二、芯片分析结果：芯片分析从两个角度进行，一是单倍体、二倍体和三倍体联合分析；二是对三倍化过程单独分析。联合分析主要结果如下：1)大部分染色体对倍性敏感程度不一样，即有些染色体上的位点在倍性变化时更容易发生表达变化；2)倍性敏感位点（倍性变化时表达发生变化的位点）存在成丛分布；3)倍性敏感位点在功能上分布不均衡；4)单倍化中表达变异频率高于三倍化但表达量与功能都差异不大；5)单倍化与三倍化中都有相当比例沉默与激活的极端表达调节类型且激活多于沉默，类似地，表达量上升也多于下降；6)单倍化与三倍化对同一基因有类似的影响，与基因组剂量效应不一致。三倍化过程中基

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第一部分文献综述

一、多倍体的形成、遗传、表达调节与进化

1.多倍体及其形成

1.1 未减数配子

1.2 合子染色体数目加倍

1.3 人工诱导多倍体

1.3.1 物理方法

1.3.2 切伤、摘心或嫁接法

1.3.3 化学方法诱导多倍体

1.3.4 花粉检出法

1.3.5 体细胞杂交法

1.3.6 胚乳培养法

2.多倍体的遗传分析

3 多倍体进化中遗传与表观遗传变异

3.1 异源多倍体中遗传与表观遗传变异

3.1.1 新合成的异源多倍体中基因组的迅速与动态性遗传变异

3.1.2 异源多倍体中转座子激活与DNA甲基化的表观遗传变异

3.2 自然异源多倍体与人工异源多倍体进化差异

3.3 同源多倍体基因表达与进化

4 多倍体中重复位点在进化中的命运及其功能分化

5 异源多倍体中DNA结构与表达变化调节机制

5.1 异源多倍体中转录组分化的重新程序化

5.2 异源多倍体中的转录调控

5.3 异源多倍体中RNA介导的基因调节

6 同源多倍体中基因表达调控的机制

二、DNA甲基化酶与DNA甲基化传递蛋白

1.DNA甲基化的概念

2 参与植物DNA甲基化的酶

2.1 甲基转移酶Ⅰ（METI,methyltransferase Ⅰ）

2.2 染色质甲基化酶（Chromomethylase,CMT）

2.3 重新甲基化酶

2.4 其它甲基化

3 5-甲基化胞嘧啶（5-mC）在植物中的含量及分布

3.1 5-甲基化胞嘧啶在植物中的含量

3.2 甲基化的位点

4.MBD蛋白与DNA甲基化识别

4.1 动物中MBD蛋白

4.2 植物中MBD蛋白

第二部分材料方法

1.研究材料与试剂设备

1.1 水稻材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器设备

2 试验方法

2.1 提取RNA、DNA的样品准备

2.2 双胚苗的种植与多倍体初步筛选

2.3 倍性鉴定

2.4 DNA粗提、纯化、定量与纯度测定

2.5 总RNA提取

2.6 SSR分析

2.7 DNA甲基化分析

2.7.1 酶切、连接、预扩、选扩

2.7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.7.3 银染

2.8 cDNA-AFLP分析

2.8.1 ss-cDNA、ds-cDNA的合成、纯化

2.8.2 酶切、连接、预扩、选扩

2.9 RT-PCR分析

2.9.1 mRNA提取

2.9.2 ss-cDNA的合成

2.9.3 RT-PCR反应

2.9.4 电泳

2.10 芯片数据处理流程

2.10.1 总RNA的提取和纯化

2.10.2 cDNA的合成和纯化

2.10.3 cRNA的合成和纯化

2.10.4 cRNA片段化、配制杂交液

2.10.5 芯片杂交

2.10.6 洗脱、染色芯片

2.10.7 扫描芯片

2.10.8 数据分析

第三部分结果与分析

一、SARⅡ-628自然同源三倍化后对DNA甲基化的影响

1 双胚苗中多倍体的筛选频率与倍性鉴定

2 基因组DNA的提取与纯化

3 微卫星分析

4 DNA酶切和PCR扩增

5 MSAP分析

5.1 三倍体甲基化程度变化不大

5.2 三倍体甲基化变异在MO代迅速发生

5.3 三倍体甲基化变异遍布于整个基因组且具有位点特异性

二、SARⅡ-628自然同源三倍化后对表达影响之基因芯片分析

1 单倍体、二倍体、三倍体基因表达联合分析

1.1 芯片分析的质量控制与概况

1.2 倍性敏感位点的不均衡分布

1.2.1 倍性敏感位点在染色体定位上的不均衡分布

1.2.1.1 大部分染色体之间对倍性的敏感程度不一致

1.2.1.2 部分倍性敏感位点在染色体上的非随机分布

1.2.2 倍性敏感位点功能上的不均衡分布

1.3 倍性敏感位点的功能分类

1.4 不同倍性变化类型分析

1.4.1 不同倍性变化中敏感位点数比较

1.4.2 不同倍性变化中表达量改变倍数差异不大

1.4.3 绝大部分对单倍化与三倍化敏感的位点功能是相似的

1.5 SARⅡ-628倍性变化中“积极”与“极端”调节方式

1.5.1 对“积极”与“极端”调节方式的偏好

1.5.2 “积极”与“极端”调节方式涉及的功能差异不大

1.6 单倍化与三倍化中共同变化位点分析

1.6.1 SARⅡ-628在倍性变化中涉及了较多的协同变化位点

1.6.2 同一位点在单倍化和三倍化过程中有相似的变化方向与趋势

2 三倍化后表达变化分析

2.1 三倍化敏感位点分布的均衡性分析

2.1.1 绝大部分染色体对三倍化的敏感程度不一致

2.1.2 三倍化敏感位点在染色体上的随机分布

2.1.3 三倍化过程中对“积极”与“极端”调节方式的偏好

2.2 三倍化中重要的功能位点表达变化

2.2.1 甲基化合成与传递相关的位点表达变化不大

2.2.2 乙烯生物合成的增加

2.2.3 较多的转录调节相关位点发生了表达变化

2.3.4 DNA重组与修复-RAD54在三倍体中的启动

三、SARⅡ-628自然同源三倍化后对表达影响之cDNA-AFLP分析

1 cDNA-AFLP分析概况

2 三倍化中表达变化能力在单株和器官间的差异

2.1 不同的三倍体单株／器官组合表达变异能力不同

2.2 三倍体单株间表达变异能力相差不大

2.3 激活能力的差异引起了器官间表达变异能力的差异

3 SARⅡ-628自然同源三倍化后多态性表达与多态性表达变化

3.1 部分位点在三倍体单株间呈多态性表达

3.2 部分位点在三倍体单株间的表达变化是多态性的

3.3 部分位点的器官特异性表达变化

四、SARⅡ-628自然同源三倍化后对表达影响之RT-PCR分析

1.部分RT-PCR结果与芯片结果不一致

2.同一位点在不同的三倍体单株／器官组合中表达存在变异

3.近一半的变异位点在三倍体群体内呈多态性表达

4.大部分变异位点表达的变化呈多态性

5.器官特异性表达变化分析

第四部分讨论

1 本实验中的多倍体水稻在多倍化对甲基化与基因表达影响研究中的特色与优势

2 方法相关的讨论

2.1 基因芯片、cNDA-AFLP、RT-PCR在基因表达研究中的优势与劣势

2.2 芯片分析的精确度

3.三倍体中基因表达变化调控的机制

3.1 三倍化后甲基化与甲基化信号传导

3.2 SARⅡ-628基因表达与基因组剂量效应的背离

3.3 转录因子与染色质异构因子的活跃

3.4 乙烯生物合成的增加

3.5 小RNA对SARⅡ-628多倍体特殊表达变化的解释

4 SARⅡ-628三倍化后没有出现较多超甲基化的可能原因

5 SARⅡ-628甲基化变异的位点特异性

6 本研究的不足与解决方案

6.1 SSR分析DNA一级结构变异不太准确

6.2 甲基化与基因表达研究的片面性

6.3 材料的可对照性还可进一步提高

6.4 跟踪并了解多倍体MO代后DNA甲基化与基因表达变异的遗传

参考文献

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