SARS冠状病毒S糖蛋白基因片段的表达及初步应用

论文题目: SARS冠状病毒S糖蛋白基因片段的表达及初步应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 刘怀然

导师: 孔宪刚

关键词: 冠状病毒,糖蛋白,基因片段,表达,初步应用

文献来源: 东北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS) ,亦称非典型性肺炎,是2002～2003 年在全球范围内爆发的一种传染性极强的呼吸系统疾病。新型SARS 冠状病毒(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV)是导致此次疾病的病原体。SARS-CoV是一种新发现的冠状病毒,其毒力远远强于其他已知的家族成员。目前对于该病毒的许多方面尚未完全明了,因而对于SARS是否会卷土重来无法预知,研制开发特异灵敏的诊断试剂以及安全有效的疫苗,都是亟待解决的问题。目前我国研制的SARS灭活苗已经进入I期临床实验阶段,血清学检测试剂盒也已经商品化。然而这二者均以灭活的SARS-CoV全病毒粒子为基础制备,其中感染性RNA存在的生物安全性无法保障;一些RNA病毒具有的抗体依赖性感染增强作用,也是SARS灭活苗研究的一大障碍;而且尽管操作SARS-CoV在P3级实验室中进行,对于这样一个既无疫苗,又无特效治疗药物,而又传染性极强的病毒来说,仍是一项非常危险的工作。鉴于此,通过生物技术手段,进行以重组蛋白为基础的、安全、经济的检测试剂的研制,以及符合生物安全、适合于人体使用的基因工程疫苗的研究开发,一直是SARS研究的热点。S 糖蛋白(Spike glycoprotein)是SARS-CoV 包膜上最重要的一种Ⅰ型糖蛋白,负责病毒的吸附、融合和侵入宿主细胞,也是诱导宿主体液免疫反应的免疫原性蛋白。S 蛋白上有众多抗原表位,SARS 康复患者血清中有针对S 蛋白的高水平抗体成分,且出现时间早,持续时间长,因此,对血清中S 蛋白特异性抗体的检测,也可作为SARS 血清学检测的标准(marker)之一。重组SARS-CoV S 蛋白与其他冠状病毒血清无交叉反应,在这一点上,S蛋白作为检测试剂研制的靶蛋白,要优于同样具有主要免疫原性的核蛋白(Nucleoprotein protein,N)。此外,S 蛋白含有重要的中和性表位,亦是SARS 疫苗设计的理想靶蛋白。SARS-CoV S 蛋白由1255 个氨基酸组成,体外表达如此大的蛋白很困难,而且表达蛋白的可溶性不高;其次,实验已经证实,全长S 蛋白含有大量无关的表位,致使表达的全长S蛋白对SARS 阳性血清的检出率低于S 蛋白片段;另外作为疫苗研究,S 蛋白上大量无关表位作为异体蛋白进入体内,会引发机体的过度免疫反应,这也是SARS-CoV 可能的致病机理之一。基于以上三点原因,有必要选择在S 蛋白上包含主要抗原表位的蛋白片段,对其反应原性和免疫原性进行研究,探究其作为重组蛋白检测试剂和基因工程疫苗研制靶抗原的潜力。SARS-CoV 的S 蛋白是一个高度糖基化蛋白,所以更适于在真核系统中表达。本实验将覆盖全长S 基因、互相重叠的8 段基因片段,克隆至杆状病毒Bac-to-Bac 系统的pFastBacHTa载体,经PCR 和酶切鉴定,构建了pFastBacHTa-SX 重组载体(X 代表S 基因各片段名称,即A、B、C、D、E、F、G1、G3)。将阳性重组pFastBacHTa-SX 转化DH10BacTM感受态细胞,提取重组Bacmid DNA 并用PUC/M13 引物进行PCR 鉴定,筛选出了各基因的阳性重组Bacmid-SX,转染Sf9 昆虫细胞。将出现病变的Sf9 细胞裂解,进行SDS-PAGE 电泳分析表达蛋白情况,并用相应S 基因片段在大肠杆菌中表达的重组蛋白免疫兔制备的单因子阳性血清,对真核表达的重组蛋白进行Western blotting 鉴定。分析鉴定结果表明,各表达蛋白大小与预期相符,并能被相应血清特异性识别,具有相应的反应原性。从而得到了分别表达S 基因8 个片段重组蛋白的重组杆状病毒rBaculovirus-SX。用2 份SARS 患者康复血清和1 份SARS 卵黄抗体,对昆虫细胞中表达的8 个重组蛋白

论文目录:

摘要

Abstract

1 引言

1.1 非典型性肺炎(SARS)研究概况

1.1.1 SARS 病原学

1.1.2 SARS 流行病学、病理学及致病机制

1.1.3 SARS 诊断、治疗及免疫预防

1.1.4 SARS 动物模型及自然宿主

1.2 SARS-CoV 主要结构蛋白及其表位研究

1.2.1 S蛋白

1.2.2 N蛋白

1.2.3 M蛋白

1.2.4 E蛋白

1.3 SARS-CoV 重组结构蛋白与SARS 血清学检测试剂的研制

1.3.1 S蛋白

1.3.2 N蛋白

1.3.3 其他

1.4 SARS-CoV 重组结构蛋白与SARS 疫苗研制

1.4.1 S蛋白

1.4.2 N蛋白

1.4.3 其他

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 含S 基因片段质粒及cDNA

2.1.2 载体、感受态细胞、引物

2.1.3 细胞培养用试剂

2.1.4 血清样品及酶标抗体

2.1.5 常规化学试剂

2.1.6 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 SARS-CoV S 基因8 个片段重组pFastBacHTa-SX 载体构建及鉴定

2.2.2 重组pFastBacHTa-SX 的转座及重组Bacmid-SX 鉴定

2.2.3 重组Bacmid-SX 转染昆虫细胞及重组病毒繁殖与滴定

2.2.4 各重组蛋白的表达分析及鉴定

2.2.5 以SARS 阳性多克隆抗体筛选免疫反应性优势片段

2.2.6 基于重组蛋白的间接ELISA 方法建立与应用

2.2.7 间接免疫荧光方法建立与应用

3 结果

3.1 重组pFastBacHTa-SX 载体鉴定

3.1.1 SARS-CoV SB 与SD 基因克隆及重组T 载体鉴定

3.1.2 pFastBacHTa 载体酶切、回收产物电泳鉴定

3.1.3 重组pFastBacHTa-SX 载体PCR 及酶切鉴定

3.2 重组Bacmid-SX(A,B,C,D,E,F,G1,G3)的PCR 鉴定

3.3 Sf9 细胞适应普通血清及各重组病毒滴度测定

3.4 重组蛋白的表达及Western blotting 检测

3.4.1 重组SA 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.2 重组SB 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.3 重组SC 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.4 重组SD 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.5 重组SE 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.6 重组SF 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.7 重组SG1 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.4.8 重组SG3 蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

3.5 SARS 阳性多克隆抗体筛选免疫反应优势性片段

3.6 重组蛋白在SARS 血清学检测中初步应用

3.6.1 间接ELISA 试验

3.6.2 间接免疫荧光试验

4 讨论

4.1 S 蛋白的免疫原性与SARS 疫苗研制

4.2 S 蛋白的免疫反应性与SARS 血清学检测试剂研制

4.3 S 蛋白表位

4.4 S 基因片段在昆虫细胞/杆状病毒系统中的分段表达

4.5 重组S 蛋白各片段免疫反应性分析

4.6 间接ELISA 与IFA 试验

4.7 后继工作

5 结论

参考文献

发布时间: 2005-10-31

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