聚乙二醇修饰降纤酶的研究

论文摘要

降纤酶在国内临床上有广泛的应用,常用于急性心肌梗塞、脑血栓等血栓疾病的治疗,其去纤、抗凝、降脂、扩张血管和改善微循环等功能得到了充分的肯定,但是在使用过程中仍具有蛋白质药物所共有的缺点——免疫原性高、稳定性差、半衰期短。 蛋白质PEG修饰技术在过去的近15年中得到了快速发展,已有多篇文献报道了经PEG修饰的蛋白质药物降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期,并用于临床治疗各种疾病。本论文工作希望通过对降纤酶的聚乙二醇化,获得低免疫原性、高稳定性的降纤酶,改善该蛋白酶的药代动力学以及给药便利程度。 在降纤酶的PEG修饰试验中,尝试了mPEG-ALD、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG2-NHS等多种PEG。结合酶活、修饰率及产物的纯度三个方面确定最佳的PEG——mPEG-SPA;通过正交试验确定最佳修饰条件,即反应缓冲液pH为6.5、降纤酶与PEG的摩尔比n为1:20、反应时间t为1h以及反应温度T为37℃。当PEG修饰在此最佳修饰条件下进行时,可以在保持降纤酶较高酶活的基础上得到最高的修饰率;在四个影响因素中,反应摩尔比对降纤酶的PEG修饰影响最显著,级差为O.191;影响最小者为反应时间,级差仅为0.045:建立了以HPLC、superdex75、SDS-PAGE等方法为主的降纤酶及其修饰产物的分离纯化、检测方法,利用分子筛柱层析得到了酶活性有较高保留的两种单一修饰产物Df-mPEG-SPA5000,Df-mPEG-SPA30000;在最佳修饰条件下,mPEG-SPA5000对降纤酶的修饰率为46.7%,降纤酶回收率为45.2%。mPEG-SPA30000对降纤酶的修饰率为38.2%,降纤酶回收率34.1%。 进行了降纤酶及其聚乙二醇单一修饰产物的性质研究,结果显示降纤酶的聚乙二醇化修饰达到预期研究目标。Df-mPEG-SPA5000酶活保持率达42.3%,Df-mPEG-SPA30000的酶活保持率为37.9%。Df-mPEG-SPA5000、Df-mPEG-SPA30000的免疫原性降低;Df-mPEG-SPA5000的稳定性提高、降纤作用时间延长。进行了修饰位点确认工作的初步研究,为进一步确认修饰位点奠定基础。 本研究工作主要内容已经申请国家发明专利,专利申请号:200410017779.4。

论文目录

• 缩写与中英文对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛋白质药物简介
• 1.2 蛋白质药物的聚乙二醇修饰
• 1.2.1 PEG修饰的原理与方法
• 1.2.1.1 氨基的修饰
• 1.2.1.2 半胱氨酸（巯基）的修饰
• 1.2.1.3 氧化的糖或N端的修饰
• 1.2.2 PEG修饰条件的选择
• 1.2.2.1 PEG修饰剂的选择
• 1.2.2.2 修饰反应的影响因素
• 1.2.3.PEG修饰过程
• 1.2.3.1 液相反应
• 1.2.3.2 固相反应
• 1.2.4 反应产物的鉴定和检测
• 1.2.4.1 蛋白质或多肽的平均修饰度
• 1.2.4.2 修饰位点和位置异构体的检测
• 1.2.4.3 偶合物的均一性
• 1.2.5 PEG修饰蛋白药物的开发与临床应用状况
• 1.3 抗凝溶栓药物——降纤酶
• 1.3.1 血栓与栓塞
• 1.3.1.1 血栓形成机制
• 1.3.1.2 溶栓药物的溶栓途径
• 1.3.2 降纤酶（Defibrase，Df）
• 1.3.2.1 降纤酶的研究历史
• 1.3.2.2 降纤酶的适应症
• 1.3.2.3 降纤酶的性质
• 1.3.3 降纤酶在溶栓市场中的表现
• 1.4 本课题的立题意义和研究内容
• 1.4.1 立题意义
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.2.1 降纤酶与PEG的修饰及产物的分离纯化
• 1.4.2.2 修饰产物的性质研究
• 第二章 降纤酶与MPEG的修饰及产物的分离纯化
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 主要材料与试剂
• 2.1.2 层析填料
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 修饰反应及分离纯化流程
• 2.2.2 Folin-酚法测定蛋白质浓度
• 2.2.3 Df酶活效价测定
• 2.2.3.1 标准溶液的配置
• 2.2.3.2 供试品溶液的准备
• 2.2.3.3 测定法
• 2.2.4 比活力计算
• 2.2.5 Df与mPEG-ALD30000的反应
• 2.2.6 Df与mPEG-SPA5000的反应
• 2.2.7 Df与mPEG-SBA5000的反应
• 2-NHS40000的反应'>2.2.8 Df与mPEG₂-NHS40000的反应
• 2.2.9 Df与mPEG-SPA30000的反应
• 2.2.10 正交试验
• 2.2.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.11.1 制备分离胶、浓缩胶
• 2.2.11.2 样品的处理与上样
• 2.2.11.3 电泳
• 2.2.11.4 固定、染色、脱色
• 2.2.12 分子筛凝胶过滤层析
• 2.2.13 阴离子交换过滤层析检测修饰纯度
• 2.2.14 HPLC测定纯度
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 Df在superdex75分子筛上的保留体积
• 2.3.2 Df的酶活曲线
• 2.3.3 Df与mPEG-ALD30000的反应
• 2.3.3.1 superdex 75分子筛分离纯化
• 2.3.3.2 superdex75检测纯度
• 2.3.3.3 SDS-PAGE检测分离液
• 2.3.3.4 酶活
• 2.3.4 Df与mPEG-SBA5000的反应液
• 2.3.4.1 superdex75分子筛分离纯化
• 2.3.4.2 superdex75分子筛检测纯度
• 2.3.4.3 SDS-PAGE分析
• 2.3.4.4 酶活
• 2.3.5 Df与mPEG-SPA5000的反应
• 2.3.5.1 分子筛凝胶过滤分离纯化
• 2.3.5.2 superdex75凝胶柱检测纯度
• 2.3.5.3 SDS-PAGE分析反应液
• 2.3.5.4 SDS-PAGE检测mDf5000分子量
• 2.3.5.5 酶活
• 2-NHS40000的反应'>2.3.6 Df与mPEG₂-NHS40000的反应
• 2.3.6.1 superdex75分子筛分离纯化
• 2.3.6.2 superdex75检测纯度
• 2.3.6.3 SDS-PAGE检测纯度
• 2.3.6.4 HiTrap Q柱分离
• 2.3.6.5 酶活
• 2.3.7 Df与mPEG-SPA30000的反应
• 2.3.7.1 superdex75分子筛分离纯化
• 2.3.7.2 分子筛凝胶过滤检测纯度
• 2.3.7.3 SDS-PAGE分析反应液
• 2.3.7.4 SDS-PAGE检测修饰产物分子量
• 2.3.7.5 酶活
• 2.3.8 HPLC分析Df、mDf5000、mDf30000
• 2.3.9 正交试验确定最佳反应条件
• 2.3.10 修饰率与回收率
• 2.4 小结
• 第三章 降纤酶及聚乙二醇化降纤酶的性质研究
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 主要材料与试剂
• 3.1.2 试验动物
• 3.1.3 主要仪器和设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 Folin-酚法测定蛋白质浓度
• 3.2.2 酶活效价测定
• 3.2.3 质谱
• 3.2.4 HPLC分析胰酶水解液
• 3.2.5 稳定性试验
• 3.2.5.1 热稳定性试验
• 3.2.5.2 抗酶切稳定性试验
• 3.2.5.3 反复冻融对酶活的影响
• 3.2.6 免疫原性试验
• 3.2.6.1 试剂配制
• 3.2.6.2 操作过程
• 3.2.7 去纤维蛋白作用试验
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 Folin-酚法测定蛋白质浓度
• 3.3.2 酶活测定
• 3.3.3 MALDI-TOF-MS分子量确认
• 3.3.4 HPLC分析胰蛋白酶水解液
• 3.3.5 稳定性试验
• 3.3.5.1 热稳定性试验
• 3.3.5.2 抗酶切稳定性试验
• 3.3.5.3 反复冻融的稳定性试验
• 3.3.6 双向琼脂扩散试验
• 3.3.7 降纤试验
• 3.4 小结
• 第四章 结论
• 第五章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 综述报告和发表论文
• 附录