抗稻瘟病基因Pib启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证

论文摘要

启动子是位于结构基因5′端上游区的调控序列,在转录水平控制着植物基因表达的时空性。研究植物抗病基因启动子,分析启动区内分子元件的功能对了解植物抗病基因的表达特异性有很重要的意义。不少与启动和诱导活性有关的分子元件在启动区内是多拷贝的。用逐段敲除这些功能性分子元件的启动子缺失体来进行转基因分析是了解这些分子元件的生物学功能的重要方法。Pib基因属于NBS-LRR抗病基因家族,是目前为数不多已克隆的抗稻瘟病主效基因之一。研究报道表明,pib基因表达不受病原菌诱导,而黑暗、温度等环境和一些化学物质却能有效地诱导pib基因的表达。研究结果还显示,将不同长短的pib结构基因序列片段置于35S驱动下,它们各自的转基因植株表现出对稻瘟病生理小种的不同抗性,而pib结构基因上游的启动区与gus基因融合构建的转基因试验也证实了pib启动子具有很强的黑暗诱导活性。由于水稻的根是处于24h黑暗环境,而地上部器官处于光/暗循环交替之下,这就使得pib基因的抗病性表达具有了特殊的器官特异性和昼夜节律性。为了探讨pib启动子这种环境条件诱导性的分子结构和分子机制,笔者用PLACE数据库对pib启动区核酸序列进行了分析,该启动区内有各种定义为启动相关分子元件近百个,除了TATA、CAAT等启动子共有元件外还有数十个不同类型的诱导性元件。其中被定义为光响应相关的顺式作用元件YTCANTYY以6个拷贝形式散布在启动子序列内。为了验证该启动子的暗诱导特性是否与此分子元件有关,这个分子元件又是怎样影响该启动子的暗诱导性的,笔者构建了不同长度、即含有不同数目的YTCANTYY元件的水稻pib基因启动子的5′端缺失体驱动gus基因的双元载体,用对其水稻转基因植株的gus基因表达分析的结果来研究该pib启动子中暗诱导分子元件的生物学功能及其对暗诱导的响应。1.用PCR扩增并测序获得4个不同长度的pib启动子片段,各片段之间的区别仅在于5’端的缺失各不相同。4个片段的3’端均终止于碱基2（ATG信号的G）,分别为:5’缺失体启动子1 PCR产物长222bp,为-219～2bp,无YTCANTYY元件,5’缺失体启动子2PCR产物长569bp,为-566～2bp,含1个YTCANTYY元件（-220～-227bp处）,5’缺失体启动子3 PCR产物长1911bp,为-1908～2bp,含3个YTCANTYY元件（-220～-227,-567～-574,-728～-735bp处）,全长启动子PCR产物长3575bp,为-3572～2bp,含6个YTCANTYY元件（-220～-227,-567～-574,-728～-735,-1909～-1916,-3042～-3049,-3382～-3389 bp处）。801（-219～2bp）、802（-566～2bp）、803（-1908～2bp）和804（-3572～2bp）分别连接进pCAMBIA1301中gus因前,取代原来的CaMV35S启动子,构建成双元载体pNAR801、pNAR802、pNAR803和pNAR804。重组双元质粒经过酶切验证,用农杆菌冻融转化法转化入农杆菌菌株EHA101中。2.利用农杆菌介导的方法,将上述pNAR801、pNAR802、pNAR803、pNAR804重组质粒转化粳稻品种R109,同时以CaMV35S启动子驱动gus基因的pCAMBIA1301作对照。共获得136株再生植株,经PCR筛选确定得到96个阳性的转基因水稻植株,阳性率70.6%。通过Southern blot检测也表明目的基因已经整合到水稻基因组中。3.对上述不同长度5′端缺失的pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株,进行Gus组织化学检测和荧光定量分析,系统研究了pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。Gus组织化学分析结果表明,含6个、3个、1个拷贝的pib启动子的转基因水稻愈伤在暗处理后均能在X-gluc溶液中显示不同深浅的Gus兰色,而6个拷贝完全缺失的启动子残端的水稻愈伤在X-gluc溶液中不显现Gus兰色。荧光定量分析结果表明,pib启动子序列具有很强的器官特异性,即便是6个暗诱导分子元件都被敲除的3’残端,其转基因植株仍保持根部启动活性高于地上部份的趋势。但其启动活性和暗诱导性随启动子缺失片段的缩短即暗诱导分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明,YTCANTYY在pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件,他能赋予启动子的暗诱导性,起码在6个拷贝以内,pib启动子的暗诱导活性是与其拷贝数目呈正相关,各个YTCANTYY分子元件的启动活性可能是累加的。4.利用pib基因启动区与gus构建的报告基因载体pNAR604得到的T3转基因水稻,继续对pib基因启动子诱导性进行研究,再次证实pib启动子活性受黑暗和温度影响,无论诱导与否,在根中的Gus活性都远高于叶片具有强烈的器官特异性,pib启动子活性无论是在根还是叶都具有明显的昼夜节律性,白昼低夜晚高,以15:00活性水平为最低,03:00活性水平为最高。这些结果表明,pib基因表达的起始或抗稻瘟病产物的合成地在根系,而不是植株叶、茎等稻瘟病发病部位。也就是说pib基因抗稻瘟病功能性产物的合成起始地与抗病的靶点分离。据此,我们推断,pib基因编码的抗稻瘟病产物是在根部起始合成,抗病基因产物在夜间由根系输送到植株地上的靶组织,实现其抗病的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 第一节 水稻稻瘟病研究进展
• 1 稻瘟病的症状及发病规律
• 2 稻瘟病菌侵染与为害机理
• 3 稻瘟病严重影响水稻产量
• 4 抗稻瘟病基因研究进展
• 4.1 稻瘟病抗性基因遗传分析与分子定位
• 4.2 稻瘟病抗性基因的克隆
• 4.2.1 传统图位克隆
• 4.2.2 电子图位克隆
• 4.3 pib基因的克隆及研究进展
• 第二节 水稻遗传转化研究
• 1 水稻转化受体系统
• 1.1 原生质体再生系统
• 1.2 愈伤组织再生系统
• 1.3 幼嫩子房转化系统
• 2 水稻遗传转化方法
• 2.1 直接转化法
• 2.1.1 基因枪法（gene gun-mediated transformation）
• 2.1.2 PEG法（PEG-mediated transformation）
• 2.1.3 电击法（electroporation-mediated transformation）
• 2.1.4 花粉管通道法（pollen tube—pathway transformation）
• 2.1.5 其他转化方法
• 2.2 间接转化方法
• 2.2.1 农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation）
• 2.2.2 其他间接转化法
• 3 水稻遗传转化中选择标记的选择
• 4 水稻遗传转化中报告基因的选择
• 5 水稻遗传转化过程中存在的问题及展望
• 5.1 基因沉默
• 5.2 选择标记基因的去除
• 5.3 外源基因在转基因植物中的最佳表达及其遗传稳定性
• 第三节 植物基因启动子的研究
• 1 启动子的基本特点
• 2 植物基因启动子核心结构及其功能
• 3 植物基因启动子的类型
• 3.1 组成型启动子
• 3.2 组织特异型启动子
• 3.3 诱导型启动子
• 4 植物基因启动子的功能分析
• 第二章 不同长度、即含有不同数目的YTCANTYY元件的pib基因启动子的5'端缺失体驱动gus基因植物表达载体的构建
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 对双元载体pCAMBIA1301的分析
• 2.2 pNAR801的构建
• 2.3 pNAR802的构建
• 2.4 pNAR803的构建
• 2.5 pNAR804的构建
• 2.6 双元载体转化农杆菌EHA101
• 第三章 农杆菌介导转化获得转基因水稻植株
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因水稻植株的获得
• 2.2 转基因植株的叶片抗潮霉素鉴定
• 2.3 转基因植株的PCR鉴定
• 2.4 转基因植株的Southern blot鉴定
• 第四章 不同长度、即含有不同数目的YTCANTYY元件的pib基因启动子的5'端缺失体驱动gus基因在转基因植株中的表达分析
• 摘要
• 1.材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同长度pib启动子-gus构建的转基因愈伤Gus组织化学检测
• 2.2 不同长度pib启动子-gus构建的转基因植株的Gus活性荧光定量分析
• 2.3 全长pib启动子及其不同缺失体构建的转基因植株暗诱导前后Gus活性荧光定量分析
• 3 讨论
• 第五章 pib基因启动子对环境因素的响应
• 摘要
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 3代种子的潮霉素抗性分析及转基因植株的PCR检测'>2.1 T₃代种子的潮霉素抗性分析及转基因植株的PCR检测
• 2代转基因植株的Gus组织化学分析'>2.2 T₂代转基因植株的Gus组织化学分析
• 3代转基因植株pib启动区诱导活性的荧光定量分析'>2.3 T₃代转基因植株pib启动区诱导活性的荧光定量分析
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢