白僵菌提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的研究

论文摘要

酪氨酸酶广泛存在于人、动物、植物和微生物中，是参与黑色素合成的关键酶。酪氨酸酶活性越高，生成的黑素也越多，其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量，控制其活力即可控制黑素生成量，因此酪氨酸酶抑制剂临床应用于与黑色素失调相关疾病的治疗且在美白化妆品应用方面具有重要作用。白僵菌作为生物防治中被应用最广泛的虫生真菌，多年来对其发酵产物中生物活性物质的研究少人问津。本研究采用安徽农业大学微生物防治重点实验室多年采集保藏的众多白僵菌菌株中挑选44株不同来源、不同寄主、不同地理来源的白僵菌作为实验对象，并对其分别进行静置发酵培养和摇床发酵培养，共得到88个培养物，对培养物进行真空冷冻干燥，然后用甲醇提取其中的活性物质以进行以酪氨酸酶二酚酶抑制率为指标的初筛实验。筛选结果显示有12个样品对二酚酶的抑制率高于50%，分别为：Bbr03（摇床）、Ba08（摇床）、Bb307（摇床）、Bb2513（摇床）、Ba03（摇床）、Ba09（摇床）、Ba14（摇床）、Ba14（静置）、Bbr59（摇床）、Ba01（静置）、Ba07（摇床）、Ba08（摇床）。以抑制单酚酶活性和二酚酶活性作为评价指标，对初筛的12个样品进行复筛实验，结果表明Ba03具有比其它11个样品更高的抑制率表现，对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制率分别为75.06%和64.43%。通过单因素实验及正交实验对Ba03菌株抑制酪氨酸酶活性成分的培养条件进行优化，发现Ba03菌株产活性成分的最佳培养基组成为：麦芽糖20g/L、甘油20g/L、黄豆粉23.3g/L、K2HPO40.05g/L、MgSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.001g/L。最佳培养工艺为：培养时间12天、种龄7天、接种量10ml、培养温度25℃、摇床转速180rpm。酪氨酸酶的IC50的测定实验结果表明，Ba03菌株发酵液提取物的单酚酶活性的IC50为223.38μg/ml，二酚酶活性的IC50为327.58μg/ml。采用RP-HPLC和活性测定联合分析发现，Ba03甲醇提取物中的活性组份主要有3个部分，它们在HPLC上的保留时间分别是24-26min、30-32min和32-34min的流份。用制备高效液相色谱（Prep-HPLC）对Ba03甲醇提取物中酪氨酸酶抑制剂进行了分离制备，得到活性组份B-1、B-2和B-3。高分辨质谱分析结果显示，该活性组分的可能分子式分别为C30H55N5O5、C10H14N6O4和C10H12N2O2。天然产物数据库查询发现它们对应的化学物质可能分别为槲寄生酰胺、2’-氨基-2’-脱氧鸟苷和一种新化合物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 白僵菌
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 研究进展
• 1.2 酪氨酸酶
• 1.2.1 酪氨酸酶概述
• 1.2.2 黑色素的成因与抑制黑色素形成途径
• 1.2.3 酪氨酸酶抑制剂的应用
• 1.2.3.1 在医药、化妆品和美容保健方面的应用
• 1.2.3.2 在食品加工及储藏领域的应用
• 1.2.3.3 在病虫害防治领域的应用
• 1.2.4 酪氨酸酶抑制剂的研究概况
• 1.2.4.1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂
• 1.2.4.2 化学合成的酪氨酸酶抑制剂
• 1.2.4.3 微生物来源的 Tyr 抑制剂
• 1.2.4.4 生物制品
• 1.2.4.5 维生素及其衍生物
• 1.2.5 酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的作用机制
• 1.2.6 白僵菌源酪氨酸酶抑制剂的应用前景
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂及耗材
• 3.1.3.1 主要仪器
• 3.1.3.2 主要药品和试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 研究方法
• 3.2.2 培养方法
• 3.2.2.1 一级种子培养
• 3.2.2.2 二级液体种子培养
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 活性物质的提取
• 3.2.3.2 酪氨酸酶活性抑制试验
• 3.2.3.3 营养性因素和非营养性因素对 Ba03 菌株抑制酪氨酸酶活性的影响
• 3.2.4 酪氨酸酶的 IC50的测定实验
• 3.2.5 高效液相色谱分析条件
• 3.2.6 HPLC-DAD-TOF/MS 分析
• 4 结果与分析
• 4.1 白僵菌提取物对酪氨酸酶抑制活性的初步筛选
• 4.2 白僵菌提取物对酪氨酸酶抑制活性的复筛
• 4.3 营养性因素和非营养性因素对 Ba03 菌株提取物抑制酪氨酸酶活性的影响
• 4.3.1 营养性因素对 Ba03 菌株抑制酪氨酸酶活性的影响
• 4.3.1.1 碳源实验
• 4.3.1.2 氮源实验
• 4.3.1.3 无机盐对 Ba03 菌株抑制酪氨酸酶活性的影响
• 4.3.2 非营养性因素对 Ba03 菌株提取物抑制酪氨酸酶活性成份生成量的影响
• 4.3.2.1 不同培养时间对抑制酪氨酸酶活性成份生成量的影响
• 4.3.2.2 种龄、接种量、培养温度和摇床转速对抑制酪氨酸酶活性成份生成量的影响
• 4.4 酪氨酸酶的 IC50的测定实验
• 4.5 活性组分的分离、鉴定确认及跟踪
• 4.5.1 Ba03 菌株甲醇提取物中活性成分分析
• 4.5.2 活性成分的初步分离、活性确认、纯度鉴定及质谱分析
• 4.5.2.1 活性成分的初步分离
• 4.5.2.2 活性确认
• 4.5.2.3 质谱分析
• 5 讨论
• 5.1 初筛方法的选择
• 5.2 影响 Ba03 菌株代谢产生抑制酪氨酸酶活性物质的营养性因素
• 5.3 影响 Ba03 菌株代谢产生抑制酪氨酸酶活性物质的非营养性因素
• 5.4 酪氨酸酶抑制率测定方法及其评价
• 5.5 活性成分的分析
• 6 结论
• 6.1 具酪氨酸酶抑制活性的菌株筛选
• 6.2 具酪氨酸酶抑制活性的菌株复筛
• 6.3 菌株 Ba03 发酵条件的研究
• 6.4 菌株 Ba03 活性抑制成分的 HPLC-TOF-MS 分析
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录