论文摘要
胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPC是生物中普遍存在的酶,主要参与糖酵解反应。近年来的研究表明其mRNA表达水平对低氧、热激、盐、低磷等多种逆境胁迫均有响应。马铃薯作为重要粮食作物,在粮食安全中起重要作用,但其生长过程中易遭受高温、干旱、低磷等胁迫,通过转基因技术提高其抗逆境胁迫能力具有重要意义。本研究主要包括三部分：1、根据已知序列从马铃薯和拟南芥中分别克隆胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的编码序列StGAPC和AtGAPC2,并构建植物表达载体；2、优化川芋10号、米拉、费乌瑞它、川芋早四个马铃薯品种试管薯切片芽再生体系,为基因转化奠定基础；3利用优化的再生体系以农杆菌浸染法转StGAPC和AtGAPC2基因到马铃薯中并筛选阳性株系。主要结果如下：（1）采用RT-PCR,分别从马铃薯和拟南芥幼苗中克隆了StGAPC和AtGAPC2的编码区,其长度均为1017bp,编码338个氨基酸,与GenBank登录的序列一致。生物信息学分析表明：两者核苷酸序列的相似性为84%,氨基酸相似性为92%；三级结构预测表明两者和水稻GAPDH C链（2e5rC）结构相似,具有GAPC保守功能域；GAPC的CDS序列在进化上表现为同科植物同源性较高归于同一分支,与现有的分类系统相对应。以pBI121为基础载体,构建了由CaMV35S启动子启动表达目的基因的载体,导入农杆菌EHA105,经PCR检测确定获得阳性克隆。（2）光培养和暗培养所结试管薯相比,光刺激下生长的薯块切片芽再生能力更强。薯块切片在不同植物生长调节剂组合下的再生结果表明：IAA的添加会引起薯片严重絮化,而用0.05-0.1mg L-12,4-D可代替IAA,使切片转绿且无絮化；6-BA和TDZ可代替ZT诱导薯块切片长芽；不同品种间的再生能力和方式存在明显差异。川芋10号再生能力最强,其芽的形成有直接再生和经愈伤分化两种方式,前者最佳组合为：MS+2mgL-1 6-BA+0.25mg L-1TDZ+0.1mgL-12,4-D,诱芽率45.53%；后者最佳组合为：MS+1mg L-1-BA+3mg L-1TDZ+0.05mgL-12,4-D+0.05 mgL-1GA3,诱芽率61.69%。米拉和费乌瑞它芽再生的方式均为直接再生,最佳诱芽组合与川芋10号相同,但诱芽率却偏低分别只有20.38%和14.10%。川芋早切片在MS+0.5mgL-16-BA+1mg L-1TDZ组合中能形成大量绿色芽点,但因迅速褐化死亡而只能得到少量芽甚至不能获得再生芽。通过去除最佳直接再生芽培养基中的蔗糖,可明显地提高川芋10号和米拉的直接再生芽率,分别可达81.23%和65.33%。以上芽再生体系的建立为下一步基因转化奠定基础。（3）用农杆菌浸染法将StGAPC和AtGAPC2基因分别转入马铃薯中,在75mg·L-1Kan下筛选抗性芽,共获得90株再生芽；在50 mg·L-1Kan下作生根筛选,但均不能正常生根；PCR扩增抗性标记基因nptⅡ,会多出两条带,而扩增GAPC基因（1029bp）却得到2000bp条带,目前只能肯定共有65株转入了外源片段,初步确定为阳性植株。将川芋10号和米拉的部分阳性株系以及相应地非转基因对照作低磷（100μmol L-1）胁迫,8d后非转基因材料川芋10号和米拉对低磷胁迫的响应有显著差异,前者只是底部叶片发黄,而后者焦枯。而转基因材料与各自的对照间也表现出明显差异,转StGAPC基因的川芋10号株系叶色正常,只是根部生长稍慢；米拉转AtGAPC2基因有叶色暗绿,茎部发紫等缺磷症状,但生长势明显优于出现焦枯的非转基因对照。24d后两转基因材料的生物量极显著高于非转基因材料,而川芋10号和米拉间的生物量差异不显著。综上所述本实验克隆了StGAPC和AtGAPC2基因,以优化的芽再生体系为遗传转化再生体系转入目的基因,初步获得表现出有低磷耐受性的株系,但这种抗性的提高是否是目的基因的过量表达造成以及其中的机理还需进一步研究。
论文目录
相关论文文献
- [1].低磷胁迫下对转AtGAPC2基因马铃薯株系的评价与筛选[J]. 四川农业大学学报 2015(02)