RNAi沉默TTF-1表达对肺癌A549细胞凋亡影响的实验研究

论文摘要

目的:恶性肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一,近年来,其发病率及死亡率均呈上升趋势。肿瘤,从本质上来讲是一种基因病,其发生发展与基因的变异、缺失、畸形等密切相关。因此,我们应该从基因的角度阐明肺癌发生、发展的机制并寻找有效的治疗靶点。现代分子生物学技术的发展和应用为肿瘤的基因治疗开辟了新的途径。最近甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor-1,TTF-1）作为肿瘤基因治疗靶点受到瞩目,它在肿瘤特别是在甲状腺和肺部肿瘤的发生和发展过程中起到一定的促进作用。该基因属于NKX-2基因家族,是一种DNA结合蛋白,分子量约38KD,由常染色体14q13的单一位点基因编码产生,参与人类肺、甲状腺和间脑组织胚胎发育中多种基因的转录,因此在这些组织细胞分化和形态发生过程中起着重要作用。在肺组织中,TTF-1可控制对肺组织发育和形态构成起关键作用的表面蛋白A、B、C及Clara细胞分泌蛋白基因;在甲状腺组织中可激活一些基因启动子如甲状腺球蛋白（TG）、甲状腺过氧化物酶（TPO）及甲状腺激素受体（TSHR）等的转录活性。目前的研究结果表明TTF-1只在肺肿瘤和甲状腺肿瘤中存在特异性高表达,作为一种特异性核转录因子和DNA结合蛋白,TTF-1可能是通过与目的基因核转录蛋白结合位点的结合,或者改变DNA结合蛋白的反应性从而正向或负向影响基因的转录。本研究旨在探讨转染TTF-1 siRNA至人腺癌A549细胞,观察转染后A549细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况,RT-PCR测定TTF-1基因在mRNA水平的表达,免疫荧光法测定转染前后蛋白的表达。方法:人工合成TTF-1基因的siRNA的片段,并将其转染至肺腺癌细胞株A549。倒置显微镜下观察细胞形态学变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡指数;逆转录-聚合酶链反应（PCR）检测TTF-1在mRNA水平的表达;免疫荧光法检测TTF-1蛋白的表达。结果:倒置显微镜观察转染前后细胞形态学变化:转染前,细胞贴壁生长,状况良好,多为梭形,大小适中,核仁清晰。转染后48小时,形态不规则,细胞皱缩,帖壁不佳,细胞突起消失。流式细胞术检测结果显示,细胞凋亡率TTF-1 siRNA转染组（32.38±2.03）%,空白对照组（0.38±0.25）%,阴性对照组（0.75±0.35）%。说明转染TTF-1 siRNA特异性抑制TTF-1,可以诱导细胞凋亡。RT-PCR检测TTF-1 mRNA表达,结果显示,TTF-1 siRNA转染至A549细胞48h后TTF-1mRNA表达显著下调,而空白对照组、阴性对照组TTF-1 mRNA表达无明显变化。说明TTF-1 siRNA可特异性阻断TTF-1 mRNA表达。免疫荧光检测TTF-1抗体表达,转染前各组抗体表达明显,呈铺路石样分布;转染后蛋白表达显著下降。结论:应用RNA干扰靶向抑制TTF-1基因表达可以显著促进A549细胞凋亡,可能成为肺癌基因治疗的新靶点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢