腺病毒介导端粒酶启动子携带双自杀基因对头颈癌和乳腺癌的基因治疗的研究

论文摘要

头颈部恶性肿瘤（Head and Neck Cancer, HNC）和乳腺癌（breast cancer）都是严重威胁人类生命和健康的疾病,但是目前对于头颈部恶性肿瘤和乳腺癌的主要治疗手段存在一系列缺点,如:抗肿瘤能力低;杀伤指数过小;副作用大等,解决这一问题的办法就是寻找高效、特异性好的治疗方法。端粒酶启动子具有在端粒酶高表达的肿瘤细胞中特异性启动的活性,用其携带自杀基因已在多种肿瘤细胞中进行了检测,目前多采用基因的联合治疗来提高疗效、避免耐药性。HSV-TK基因和Coli.NTR基因是两种使用比较广泛的自杀基因,对于HSV-TK和其前药GCV的研究深入透彻,,HSV-TK具有强大的直接杀伤细胞的作用,但是旁观者效应需要细胞间交通的辅助,且不能杀伤非分裂期细胞,所以杀伤肿瘤的效果受到了一定的限制。Coli.NTR的研究起步较晚,但它具有不依赖细胞间交通的强大的旁观者效应,且可以杀伤分裂期与非分裂期的细胞,目前二者在同一载体上的联合使用未见报道。经前期研究表明,端粒酶在头颈癌和乳腺癌中都是高表达,因此我们选择以腺病毒为载体,hTERT启动子携带这两种自杀基因,期望可以在减少两种基因和前体药物用量的前提下,最大可能的提高对于肿瘤的特异性抑制活性。实验结果显示,hTERT在实验肿瘤细胞中具有特异性启动活性,HSV-TK基因和Coli.NTR基因联合使用对于肿瘤细胞的抑制作用比其中任意一个自杀基因单独使用强。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 第一节 背景知识
• 一 肿瘤的基因治疗
• 二 自杀基因疗法
• 1. 自杀基因疗法的优缺点
• 2. 自杀基因系统的种类
• 3. HSV-TK/ GCV系统
• 4. Coli.NTR/CB1954 系统
• 5. 双自杀基因联合应用
• 三 靶向性自杀基因疗法
• 1. 肿瘤特异启动子
• 2. 端粒酶催化亚单位启动子
• 3. 端粒酶的结构与功能
• 4. 端粒酶与肿瘤
• 5. hTERT启动子的结构与功能
• 6. hTERT启动子与肿瘤治疗
• 四 肿瘤基因治疗的载体
• 1. 基因治疗的载体及分类
• 2. 腺病毒基因治疗载体
• 第二节 论文设计
• 一 靶细胞系的选择
• 二 论文目的
• 1. 头颈癌和乳腺癌的端粒酶及hTERT启动子活性
• 2. 自杀基因抑制头颈癌和乳腺癌细胞的生长
• 三 实验设计
• 1. 实验方案
• 2. 实验流程
• 第二章 材料与方法
• 第一节 实验材料
• 一 细胞、质粒、病毒和动物
• 二 主要试剂
• 三 抗体
• 四 主要仪器
• 五 常规试剂
• 第二节 实验方法
• 一 hTERT启动子在头颈癌及乳腺癌细胞中的特异性启动
• 1. 实验细胞株端粒酶活性检测
• 2. hTERT在真核载体中的特异性启动
• 3. hTERT在腺病毒载体中的特异性启动
• 二 HSV-TK和Coli.NTR联合抑制乳腺癌及头颈癌细胞
• 1. 含双自杀基因重组腺病毒的获得
• 2. 双自杀基因在体外肿瘤细胞中的联合作用
• 3. 双自杀基因在荷瘤裸鼠体内的联合作用
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 腺病毒载体的选择策略
• 第二节 端粒酶启动子的肿瘤特异性
• 一 端粒酶在正常细胞和肿瘤细胞中的表达
• 1. 端粒酶检测方法的选择
• 2. 端粒酶活性的检测
• 二 hTERT在真核载体中的特异性启动
• 1. 真核表达载体的选择
• 2. hTERT在真核表达载体中启动活性检测
• 三 hTERT在腺病毒载体中的特异性启动
• 1. 重组腺病毒Ad-CMV-TK-enh、Ad-hTERT-TK-enh的鉴定
• 2. Ad-hTERT-TK-enh在体外肿瘤细胞中TK蛋白的特异性表达
• 3. Ad-hTERT-TK-enh在荷瘤小鼠肿瘤中的特异性活性
• 第三节 HSV-TK和Coli.NTR联合抑制头颈癌及乳腺癌细胞生长
• 一 HSV-TK和Coli.NTR双自杀基因联合选择策略
• 二 携带双自杀基因的重组腺病毒的鉴定
• 三 双自杀基因在体外肿瘤细胞中的联合作用
• 四 双自杀基因及其前药对于ZR-75-30 细胞的凋亡作用
• 五 双自杀基因在荷瘤裸鼠体内的联合作用
• 六 荷瘤裸鼠肿瘤TNF-α检测
• 七 双自杀基因及其前药对于荷瘤裸鼠主要脏器的影响
• 八 双自杀基因联合使用的可能机制
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 作者简历