苏云金芽胞杆菌菌株CT-43产苏云金素及其缺失突变株的差异蛋白

论文摘要

苏云金素（thuringiensin）是由苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）某些菌株产生的一种热稳定的外毒素,它是一种核苷类似物,分子量701,它的作用机制是通过和ATP竞争酶的结合位点,从而抑制DNA依赖性RNA聚合酶的活性,所以具有广谱的杀虫活性。并且,苏云金素的毒性远低于大多数化学农药,所以它具有广谱杀虫剂的开发潜力。为了研究苏云金芽胞杆菌中苏云金素合成基因簇的代谢途径,利用双向电泳技术研究了苏云金芽胞杆菌高产苏云金素的野生菌株CT-43、其高产突变菌株CT-43-1C及不产突变菌株F-15在蛋白表达水平上的差异,通过软件分析并对差异蛋白点进行质谱鉴定,最后对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析。与野生型菌株和高产菌株相比,在F-15中发现了13个差异显著的蛋白点,鉴定出了其中的9个,生物信息学结果显示有6个蛋白可能与苏云金素合成或代谢相关。其中,F-15菌株相对于高产菌株而言,二羟基丙酮激酶和N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的缺失以及乌头酸水合酶1表达量的提高可能与苏云金素的代谢调控相关;UvrB/UvrCprotein表达量的降低可能与苏云金素的分泌途径相关;另外还发现phoH protein的缺失,可能与苏云金素合成途径中含磷的代谢中间物以及代谢能量相关;而亮氨酸-tRNA合成酶的含量的降低,导致突变菌株的生理代谢水平降低,从而可能影响到苏云金素的合成。本文通过蛋白质组研究找到了6个可能与苏云金素合成或代谢相关的蛋白,为苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径的验证提供了有力的证据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 苏云金素
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.1.2 苏云金素的产生
• 1.1.3 苏云金素的纯化和检测方法
• 1.1.4 苏云金素的活性及其作用机理
• 1.1.5 苏云金素的产生和内生质粒的关系
• 1.1.6 苏云金素合成基因簇的研究进展
• 1.1.7 苏云金素的安全性和毒性评价
• 1.1.8 苏云金素的应用前景
• 1.2 蛋白质组学简介
• 1.3 研究目的
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基及培养条件
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 苏云金芽胞杆菌菌株的培养
• 2.2.2 苏云金芽胞杆菌菌株的蛋白样品制备
• 2.2.3 苏云金芽胞杆菌菌株蛋白样品的定量
• 2.2.4 苏云金芽胞杆菌菌株蛋白双向电泳
• 2.2.5 苏云金芽胞杆菌蛋白质组pI范围的确定
• 2.2.6 苏云金芽胞杆菌菌体蛋白双向电泳分离胶浓度的选择
• 2.2.7 图像扫描与分析
• 2.2.8 质谱检测及数据库查询
• 3 结果与分析
• 3.1 苏云金芽胞杆菌菌体蛋白双向电泳体系的建立
• 3.1.1 苏云金芽胞杆菌菌体蛋白制样条件的优化
• 3.1.2 苏云金芽胞杆菌菌体蛋白双向电泳pI范围的确定
• 3.1.3 苏云金芽胞杆菌菌体蛋白双向电泳SDS-PAGE凝胶浓度的确定
• 3.2 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43产苏云金素及其缺失突变株的差异蛋白
• 3.2.1 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43产苏云金素及其缺失突变株的蛋白质组学差异比较
• 3.2.2 差异蛋白点的胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定
• 4 讨论
• 4.1 苏云金芽胞杆菌菌体蛋白样品的制备及双向电泳
• 4.2 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43产苏云金素及其缺失突变株的差异蛋白与苏云金素的关系
• 4.3 进一步研究及展望
• 参考文献
• 已发表文章
• 致谢