水稻条斑病菌harpin基因的筛选和胞外多糖相关基因的鉴定

论文摘要

水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）引起水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak, BLS）,在生产上造成水稻产量的严重损失。目前水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）中鉴定的harpin基因为hpal,其位于核心hrp基因簇内。Hpal蛋白依赖于出口控制蛋白HpaB从Ⅲ型分泌系统（TypeⅢsecretion system, T3SS）分泌。本研究前期工作发现,hpal单突变体和hpa1hpaB的双突变体均能在非寄主烟草上激发HR反应,这表明除了hpal之外Xoc中还存在其他的harpin类似蛋白。本研究以Xoc的hpa1hpaB的双突变体为宿主菌,构建了一个由Tn5转座子介导的容量达10000的突变体文库,在两种不同的非寄主植物烟草和番茄上进行HR反应的测定。测定结果显示,菌液浓度为OD600=0.5,在烟草和番茄上都丧失HR的突变体为4个,仅在烟草上丧失HR的突变体为42个,在烟草上HR减弱的突变体为2个；OD600=0.3时,在烟草和番茄上都丧失HR的突变体为9个,仅36个突变体在烟草上失去HR,1个突变体在烟草上HR减弱。这些筛选结果为后续harpin基因的鉴定奠定了工作基础。水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,以下简称Xoc）同其他植物病原黄单胞菌一样,也产生各种胞外酶和丰富的胞外多糖（extracellular polysaccharides,以下简称EPS）。植物病原黄单胞菌的EPS主要由gum, xan和wxoc等3个基因簇控制产生,但在不同的黄单胞菌中这3个基因簇的遗传组成存在很大差异。目前研究的最为透彻的EPS是Xanthomonas campestris pv. campestris中的黄原胶xanthan gum。该EPS产物主要由12个基因（从gumB到gumM）组成的gum基因簇控制。xan基因簇在植物病原黄单胞菌中也高度保守,而wxocA和wxocB基因仅在Xoc中存在。是否在Xoc中还存在其他未知的控制胞外多糖产生的基因或者基因簇,目前还不清楚。本实验室前期工作构建了Tn5插入的Xoc突变体库,获得了17个胞外多糖产量改变的突变体。为了探索Xoc中是否存在未知的EPS相关基因,本研究对这些突变体的突变位点以及在水稻上的毒性进行了分析,确认了胞外多糖减少的11个突变体中多数为Tn5插入在已知的gum、xan和wxoc基因簇上, Xoryp4217、Xory（?）,2488和Xoryp0918为未知的与胞外多糖产生有关的基因,属首次报道；6个胞外多糖增多的突变体中,fimO、pilY和xopQ与胞外多糖产生有关,但在水稻条斑病菌中未见报道；Xoryp2392、Xoryp4221和Xoryp3511为首次鉴定,其中Xoryp3511仅在水稻黄单胞菌中存在。这些结果为进一步分析水稻条斑病菌胞外多糖代谢途径以及与水稻的互作关系奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 植物病原细菌harpin蛋白的研究进展
• 第一节 植物病原细菌的harpin蛋白
• 1.1 第一个harpin蛋白的发现
• 1.2 harpin蛋白的命名及其特点
• 1.3 harpin蛋白的功能及其应用
• Xoc的应用'>1.4 harpin_Xoc的应用
• 第二节 植物病原细菌的hrp基因研究
• 1 hrp基因的发现
• 2 hrp基因簇
• 3 植物病原黄单胞菌的hrp基因簇
• 4 hrp基因的生化功能
• 第二章 细菌胞外多糖的研究
• 1 CPS（capsular polysaccharide,CPS）
• 2 LPS（lipopolysaccharide,LPS）
• 3 EPS（exopolysaccharides,EPS）
• 4 黄原胶
• 研究内容
• 第一章 水稻条斑病菌harpin基因的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基、抗生素及培养条件
• 1.3 试剂和仪器
• 1.4 供试植物材料
• 1.5 突变体库的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 初筛在番茄上丧失HR反应的突变体
• 2.2 初筛在烟草上丧失HR反应的突变体
• 2.3 番茄和烟草的HR筛选
• 3 结论与讨论
• 第二章 水稻条斑病菌胞外多糖相关基因的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株和培养条件
• 1.2 培养基、抗生素及培养条件
• 1.3 试剂和仪器
• 1.4 供试材料
• 1.5 Xoc突变体库的构建
• 1.6 突变体位点和拷贝数的确认
• 1.7 突变体在水稻上的致病性和毒性测定
• 1.8 胞外多糖产量测定
• 1.9 胞外多糖突变体游动性实验
• 2 结果与分析
• 2.1 水稻条斑病菌胞外多糖相关突变体
• 2.2 胞外多糖产量测定
• 2.3 胞外多糖相关突变体中Tn5插入拷贝数分析
• 2.4 17个胞外多糖相关突变体的Tn5插入位点的基因鉴定
• 2.5 胞外多糖相关突变体在水稻上的毒性
• 2.6 胞外多糖相关突变体的游动性
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 攻读硕士学位期间发表的文章
• 致谢