稳定表达鸡恒定链基因的P815细胞株的建立及鉴定

论文摘要

恒定链（invariant chain,Ii）是主要组织相容性复合体（Major histocompatibilitycomplex，MHC）Ⅱ类分子的伴侣蛋白之一，具有辅助其递呈外源性抗原的功能。近期研究表明Ii还可作为细胞因子MIF的受体介导炎症、肿瘤等多种疾病的发生。人和哺乳动物Ii研究较为深入，禽类起步较晚，为了对鸡Ii的结构与功能进行深入研究，我们拟建立稳定表达Ii的P815细胞株。首先以实验室保存的PMD18-T/Ii重组质粒为模板，根据其中鸡Ii基因的序列，设计一对引物，通过PCR获得了鸡Ii链全长基因片段。然后将其插入到真核荧光表达载体pDsRed2-N1，pEGFP-C1构建得到重组质粒pDsRed2-N1/Ii，pEGFP-C1/Ii，经过卡那霉素抗性筛选，EcoR I、Sal I双酶切，PCR初步鉴定正确后，由上海生工进一步测序鉴定。通过XfectT M脂质体转染试剂盒将鉴定正确的重组质粒瞬时转染到COS7细胞，观察GFP-Ii,RFP-Ii表达情况，发现荧光主要分布于细胞内膜系统。之后我们对人、牛、鸡、鹌鹑的恒定链进行了一系列生物信息学分析，包括序列比对、进化树的绘制、蛋白质结构的预测和细胞内定位特性的预测。发现此4个物种的Ii链同源性达到61.69%，其中人与牛同为哺乳动物同源性高达81.3%，鸡与鹌鹑同为禽类，同源性高达85.6%。进化树也表现出同样的规律，人与牛，鸡与鹌鹑分别表现出更近的进化关系。在对该4个物种Ii蛋白质结构模拟后，发现它们具有高度的结构相似性，因此我们推测它们的功能也是极为类似的，而经过预测我们发现它们的细胞内定位特性也确实十分相似。最后我们将pEGFP-C1/Ii转染到P815细胞，通过G418压力筛选获得了抗3mg/ml G418的P815细胞株，RT-PCR结果表明该细胞株具有稳定表达Ii的能力。通过对P815-GFP-Ii的荧光显微镜观察我们发现GFP-Ii主要定位于细胞内膜系统，在前人研究的基础上，联系Ii细胞内定位特性预测结果，我们推测Ii在细胞核定位时主要分布与核膜上。本研究成功构建了pDsRed2-N1/Ii，pEGFP-C1/Ii真核表达重组质粒，获得了稳定表达绿色荧光蛋白-鸡Ii融合蛋白的小鼠肥大细胞瘤P815细胞株，为针对Ii的抗肿瘤免疫学药物的药效评价建立了肿瘤细胞模型，同时为进一步研究Ii的结构与功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号表
• 目录
• 文献综述
• 1 Ii 的分子结构
• 2 Ii 的功能
• 2.1 作为 MHC-II 类分子的分子伴侣
• 2.2 促进 B 细胞成熟
• 3 Ii 与疾病的关系
• 3.1 Ii 与肿瘤疾病的关系
• 3.2 Ii 与炎症的关系
• 3.3 Ii 与自身免疫病的关系
• 3.4 Ii 与其他疾病的关系
• 4 Ii 的应用
• 4.1 作为一种新型的免疫载体
• 4.2 免疫调节
• 4.3 作为多种疾病的药物靶分子
• 5 国内外研究概况
• 6 研究目的与意义
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒、工程菌和细胞株
• 1.2 主要工具酶与试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.3.1 培养细菌所用试剂
• 1.3.2 细胞培养所用试剂
• 1.3.3 制备感受态细胞所用试剂
• 1.3.4 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.4 主要仪器
• 1.5 真核荧光表达载体 pEGFP-C1/Ii, pDsRed2-N1/Ii 的构建
• 1.5.1 引物设计
• 1.5.2 Ii 基因全长的 PCR 扩增
• 1.5.3 PCR 产物的回收和纯化
• 1.5.4 鸡 Ii 基因真核荧光表达质粒的构建
• 1.6 稳定表达 Ii P815 细胞株的建立
• 1.6.1 真核转染超纯质粒 DNA 的提取
• 1.6.2 P815 细胞的复苏、传代及转染准备
• 1.6.3 G418 工作浓度的确定
• 1.6.4 脂质体介导的转染
• 1.6.5 稳定表达 Ii P815 细胞株的 G418 筛选
• 1.6.6 稳定表达 Ii P815 细胞株的 RT-PCR 鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 鸡 Ii 基因 PCR 产物检测
• 2.2 重组质粒 pEGFP-C1/Ii 的双酶切与 PCR 鉴定
• 2.3 pEGFP-C1，pEGFP-C1/Ii 真核超纯质粒的检测
• 2.4 不同物种 Ii 蛋白质序列同源性比较和进化树制作
• 2.5 折叠识别方法预测不同物种 Ii 蛋白质结构
• 2.6 WoLF PSORT Prediction 预测 Ii 细胞内定位特性
• 2.7 瞬时转染 COS7 细胞荧光观察
• 2.8 G418 筛选工作浓度确定
• 2.9 稳定阳性克隆株 P815-GFP-Ii RT-PCR 结果
• 2.10 荧光显微镜下 P815-GFP-Ii 的 Ii 表达与定位情况
• 2.11 P815-GFP-Ii 细胞株稳定性的鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 重组质粒的构建与鉴定
• 3.1.1 Ii 基因片段的获取
• 3.1.2 阳性重组质粒的鉴定
• 3.2 P815 细胞的冻存与复苏
• 3.3 真核重组质粒稳定转染
• 3.4 P815-GFP-Ii 细胞株的 RT-PCR 检测
• 3.5 鸡 Ii 基因生物信息学分析
• 3.6 应用 P815-GFP-Ii 的展望
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介