牦牛CAPN1和CAST基因克隆及其序列分析

论文摘要

钙激活蛋白酶（Calpains）是一类特异性依钙激活的中性半胱氨酸内肽酶,其广泛地分布于绝大多数动物细胞中。其中μ-calpain是在体内由微摩尔钙激活的无组织特异性的钙蛋白酶,其大亚基蛋白编码基因为CAPN1基因。钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）是高效的,专一的钙激活蛋白酶活性抑制剂。研究表明,μ-calpain对于肌原纤维的降解和肉在冷冻贮藏过程中的嫩化具有重要作用,其大亚基的编码基因CAPN1可作为影响肌肉嫩度的数量性状位点（QTL）的候选基因。其抑制剂CAST可抑制蛋白酶活性,降低蛋白质水解,它的活性比值与嫩度高度相关。本研究根据GenBank发表的普通牛CAPN1和CAST基因序列设计特异性引物,以天祝白牦牛cDNA为模板,分段进行RT-PCR扩增,克隆,测序。应用生物软件BioEdit对各测序结果进行序列拼接共获得牦牛CAPN1 cDNA片段2267bp,其中包含一个2151bp的完整的开放阅读框（ORF）,以及3’和5’末端非编码区的部分序列（77bp和166bp）。获得牦牛CAST基因片段2445bp,其中包含一个2361bp的完整的开放阅读框（ORF）（含一个起始密码子ATG和终止密码子TAA）。分析表明:牦牛CAPN1基因编码区全长2151bp,共编码716个氨基酸。与已报道的牛、猪、人、小鼠的序列进行比较,核苷酸同源性分别为99.3%,93.9%,90.0% ,85.5%。预测氨基酸的同源性分别为99.4%,96.1%,94.6%,89.0%,并且对牦牛CAPN1四个结构域分别进行NCBI BLAST发现四个结构域在以上四个物种中都显示出很好的保守性,最为保守的在结构域Ⅳ（>96%）。牦牛与牛产生的14个核苷酸突变位点中,有3个产生了氨基酸突变,均发生在结构域Ⅲ。牦牛CAST基因的编码区全长2361bp,编码786个氨基酸。同源性分析表明其核酸和蛋白质序列在不同哺乳动物之间也有很高的同源性,一些亲水性的氨基酸在不同物种间具有高度的保守性。分别对两个基因构建分子系统进化树表明:聚类结果与传统分类学相符。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 前言
• 第一章 肉类嫩度的研究进展
• 1.1 肉的嫩度
• 1.1.1 基础硬度
• 1.1.2 尸僵硬度
• 1.2 影响肉嫩度的因素
• 1.2.1 影响肉类嫩度的遗传因素
• 1.2.2 加工温度对嫩度的影响
• 1.2.3 改善肉质嫩度的途径
• 第二章 钙激活蛋白酶系统的研究进展
• 2.1 钙激活蛋白酶的研究进展
• 2.1.1 钙激活蛋白酶的概述
• 2.1.2 影响钙激活蛋白酶活性的因素
• 2.1.3 钙激活蛋白酶与肉的嫩化的关系
• 2.1.4 钙激活蛋白酶的多态性与肌肉嫩度相关性的研究
• 2.2 钙激活蛋白酶抑制蛋白的研究进展
• 2.2.1 钙激活蛋白酶抑制蛋白对钙激活蛋白酶的抑制作用
• 2.2.2 钙激活蛋白酶抑制蛋白的结构与功能
• 2.2.3 钙激活蛋白酶抑制蛋白与肌肉嫩度的关系
• 第三章 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 组织样品
• 3.1.2 菌株与克隆载体
• 3.1.3 DNA 分析软件
• 3.1.4 试验仪器和试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 牦牛背最长肌组织样品的采取
• 3.2.2 牦牛CAPN1 基因及CAST 基因的PCR 扩增与克隆测序
• 第四章 结果与分析
• 4.1 牦牛CAPN1 和CAST 基因克隆及序列分析
• 4.1.1 牦牛背最长肌总RNA 的提取
• 4.1.2 RT-PCR 的扩增结果
• 4.1.3 PCR 产物的克隆及阳性克隆的菌落PCR 鉴定
• 4.1.4 基因测序与序列分析
• 第五章 讨论
• 5.1 基于牦牛CAPN1 基因克隆的讨论
• 5.2 基于牦牛CAST 基因克隆的讨论
• 第六章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录一 缩写表
• 附录二 试验相关溶液的配制
• 附录三 论文相关材料
• 个人简介
• 导师简介