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重组人胰高糖素样肽-1突变体的串联体与人血清白蛋白融合蛋白的纯化及纯度鉴定

2020-12-01阅读(278)

重组人胰高糖素样肽-1突变体的串联体与人血清白蛋白融合蛋白的纯化及纯度鉴定

论文摘要

本文利用构建好的重组Pichia Pastoris KM71/(GLP-1A2G)2-HSA酵母工程菌株表达系统进行了发酵条件优化,并对目标蛋白进行了较深入的纯化工艺研究和简单的体内、体外活性研究。将生产菌株增菌培养至一定菌体量后,用BMMY培养基悬浮菌体后定时添加甲醇进行诱导培养。研究表明重组Pichia Pastoris KM71/(GLP-1A2G)2-HSA的最佳诱导条件为温度30℃、pH6.0、甲醇浓度2.0 %、诱导时间为60 h。此最优化条件既节省反应材料,又可以提高效率,目标蛋白的最高产量可达到210 mg/L。发酵液经过4℃,10000rpm,15min离心除菌离心后,采用截留分子量为10KDa的Biomax超滤膜对发酵上清进行浓缩,浓缩倍数可达到20倍,回收率最高可达到90%。在精细分离过程中,首先将浓缩后的发酵液上Q-Seperose Fast Flow阴离子交换层析,上样后进行阶段洗脱,目标蛋白在盐浓度达到0.1mol/L时开始被洗脱下来,回收率达74%。所得到的洗脱成分处理后上HPLC检测,结果显示纯度为90%,SDS-PAGE显示为一条带。将Q-Seperose阴离子交换层析后的洗脱液浓缩后上Sephacryl S-200凝胶过滤,结果出现两个蛋白吸收峰,经检测后一个峰为目标蛋白分子吸收峰。将蛋白活性峰上HPLC检测,结果显示纯度达98%以上,经I125标记后,采用TCA沉淀法测定放射化学纯度达97%,纯度优于药代动力学研究的要求,达到了预期纯化目标。本纯化工艺由发酵上清经超滤、离子交换、凝胶过滤共3步组成,与文献报道的重组人血清白蛋白纯化工艺相比,具有流程简单、回收率高和成本较低等优点,为本产品的工业化生产奠定了基础。融合蛋白rh(GLP-1A2G)2-HSA在体外对胰岛原代细胞生长有较好的刺激作用,在浓度40 nmol/L时增殖率为35.4%,与单体的GLP-1有相似的增殖作用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 研究背景
  • 1.2 胰高糖素样肽-1 及其对糖尿病的治疗
  • 1.2.1 GLP-1 的发现
  • 1.2.2 GLP-1 的活性及对糖尿病的作用
  • 1.3 重组蛋白融合技术与人血清白蛋白
  • 1.3.1 长效重组蛋白研究背景
  • 1.3.2 长效制剂
  • 1.3.3 构建突变体
  • 1.3.4 基因融合
  • 1.3.5 人血清白蛋白的特性
  • 1.4 蛋白质特性与分离纯化技术的选择
  • 1.4.1 分子大小与形状
  • 1.4.2 分配系数与溶解度
  • 1.5 重组白蛋白的纯化
  • 1.6 本课题研究的内容和意义
  • 1.6.1 本课题研究的基础
  • 1.6.2 本课题研究的内容
  • 1.6.3 本课题研究的意义
  • 第二章 实验材料和方法
  • 2.1 菌种、细胞和KM 小鼠
  • 2.2 试剂
  • 2.2.1 培养基
  • 2.2.2 层析介质
  • 2.2.3 蛋白浓度测定试剂
  • 2.2.4 蛋白质电泳试剂
  • 2.2.5 其他试剂
  • 2.3 仪器
  • 2.3.1 菌体发酵及发酵条件优化仪器
  • 2.3.2 蛋白质纯化与纯度鉴定仪器
  • 2.3.3 活性鉴定仪器
  • 2.3.4 其他常用仪器
  • 2.4 实验方法
  • 2.4.1 融合蛋白的表达
  • 2.4.2 发酵条件的初步优化
  • 2.4.3 超滤浓缩
  • 2.4.4 盐析
  • 2.4.5 大孔树脂脱色
  • 2.4.6 离子交换层析
  • 2.4.7 凝胶过滤层析
  • 2.4.8 蛋白质纯度测定方法
  • 2.4.9 蛋白质含量测定方法
  • 2.4.10 融合蛋白的western blot 鉴定
  • 2.4.11 融合蛋白等电点的测定
  • 2.4.12 融合蛋白的体外活性实验
  • 第三章 结果与讨论
  • 3.1 发酵条件的优化
  • 3.1.1 诱导剂甲醇量的优化
  • 3.1.2 诱导培养基pH 的优化
  • 3.1.3 诱导时间的优化
  • 3.1.4 发酵条件优化总结
  • 3.2 融合蛋白分离纯化
  • 3.2.1 融合蛋白的超滤浓缩
  • 3.2.2 融合蛋白的盐析
  • 3.2.3 融合蛋白的大孔树脂脱色
  • 3.2.4 融合蛋白的离子交换
  • 3.2.6 融合蛋白的凝胶层析
  • 3.2.7 融合蛋白的纯化过程总结
  • 3.3 融合蛋白的western blot 鉴定
  • 3.4 融合蛋白等电点的测定
  • 3.5 融合蛋白的纯度鉴定
  • 3.5.1 SDS-PAGE 纯度鉴定
  • 3.5.2 HPLC 纯度鉴定
  • 3.5.3 放射性化学纯度鉴定
  • 3.6 融合蛋白的体外活性实验
  • 3.7 本章结论
  • 论文总结及展望
  • 一、主要结论
  • 二、存在问题及展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 相关论文文献

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