海洋芽孢杆菌酯酶BSE-1的分离纯化和生化性质研究

论文摘要

海洋芽孢杆菌酯酶BSE-1,是一株海洋芽孢杆菌（Bacillus sp.）分泌的碱性嗜热酶,本文主要针对海洋细菌酯酶产生菌的菌种筛选和鉴定、酯酶分离纯化、酶学性质、酶的催化动力学以及热失活动力学进行了系统研究。以期为进一步研究海洋酯酶的酶学特性、结构与功能的关系创造条件,同时也为海洋细菌酯酶的工业化生产和应用奠定良好的基础。菌种筛选过程中,根据酯酶的作用特性和机理,在培养基中添加三丁酸甘油酯和橄榄油等特异底物和Rhodamine B等指示剂,建立了一种简便有效的筛选模型,最终筛选出酯酶的高产菌株（ EB-1）,产酶活力达到22.8 U/ mL。在此基础上对菌株EB-1进行了形态结构、培养特征、生理生化特征等常规分类鉴定和16S rDNA的分子分类鉴定研究,最终将该菌株鉴定为Bacillus subtilis var. niger。在发酵培养基中添加0.5%的橄榄油和0.5%的甘油后,成功将胞内酯酶诱导到胞外。胞外酯酶发酵液通过低温高速离心（10 000r/min,30min,4℃）、乙醇-硫酸铵双水相沉淀和Q-Sepharose HR阴离子交换层析等技术进行纯化,最终得到电泳纯的酯酶BSE-1。SDS-PAGE结果表明,该酶表观分子量为30 kDa。以对硝基苯磷酸酯（PNPP）为底物对BSE-1进行理化性质研究,结果表明,BSE-1的最适反应温度为60℃,最适pH=10.0,为嗜热碱性酯酶;BSE-1在60℃以下、pH 711范围内具有良好的热稳定性;与常见酸根离子、有机溶剂的配伍性较好,但金属离子对酶活影响较大,Li+、Mg2+、Ca2+有激活作用,Ba2+、Fe3+、Ag+、Sr2+有抑制作用。EDTA对BSE-1的抑制作用明显,在反应体系中添加EDTA的浓度≥0.5mmol/L时, BSE-1的酯酶活性完全被抑制。以PNPP为底物,对电泳纯BSE-1的催化性质、催化动力学和热失活动力学进行了研究。BSE-1的酶促反应动力学符合米氏方程,其中Km=8.15 mmol·L?1, Vmax=0.97 mmol·mg?1·min?1。金属离子动力学研究表明,Ca2+为混合型激活作用,Ba2+为非竞争性抑制作用。构建BSE-1热失活的连续模型,并对BSE-1在70℃的热失活过程进行模拟,求得酶的失活速率常数k1=1.41,k2=0.28。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 立题背景和研究意义
• 1.2 海洋微生物资源的开发与利用
• 1.3 微生物酯酶的研究概况
• 1.3.1 产酯酶的微生物类群
• 1.3.2 微生物酯酶的菌种筛选方法
• 1.3.3 微生物酯酶的最新研究进展
• 1.4 微生物酯酶分离纯化的研究进展
• 1.4.1 常规的分离纯化技术
• 1.4.2 新颖的分离纯化技术
• 1.5 微生物酯酶的性质和应用
• 1.5.1 微生物酯酶和脂肪酶的差异
• 1.5.2 微生物酯酶的酶学性质
• 1.5.3 微生物酯酶的催化性质
• 1.5.4 微生物酯酶的应用研究
• 2 海洋细菌酯酶产生菌的筛选与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂和仪器
• 2.1.2 样品和培养基
• 2.1.3 发酵培养条件
• 2.1.4 筛选方法
• 2.1.5 酯酶活力测定法
• 2.1.6 常规分类鉴定
• 2.1.7 分子分类研究
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 产酯酶菌株筛选结果
• 2.2.2 常规分类鉴定
• 2.2.3 分子分类鉴定
• 2.3 本章小节
• 3 海洋芽孢杆菌酯酶BSE-1 的分离纯化研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种和培养条件
• 3.1.2 试剂和仪器
• 3.1.3 BSE-1 的活力测定
• 3.1.4 蛋白质含量测定
• 3.1.5 BSE-1 的同工酶研究
• 3.1.6 BSE-1 的诱导剂研究
• 3.1.7 BSE-1 的分离纯化研究
• 3.1.8 SDS-PAGE 对BSE-1 纯度的检测和分子量的确定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 海洋微生物酯酶BSE-1 的同工酶研究
• 3.2.2 BSE-1 的诱导剂研究
• 3.2.3 海洋微生物酯酶BSE-1 的纯化
• 3.3 本章小结
• 4 海洋芽孢杆菌酯酶BSE-1 的酶学性质研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 试剂和仪器
• 4.1.3 BSE-1 的活力测定
• 4.1.4 蛋白质含量测定
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 BSE-1 的等电点的确定
• 4.2.2 BSE-1 的最适温度和pH
• 4.2.3 温度与pH 值对BSE-1 的稳定性影响
• 4.2.4 金属离子对BSE-1 活性的影响
• 4.2.5 常见酸根离子对酯酶活性的影响
• 4.2.6 常见有机溶剂对酶活性的影响
• 4.2.7 EDTA 对BSE-1 的酶活影响
• 4.2.8 BSE-1 的底物选择性
• 4.2.9 芽孢杆菌酯酶的性质比较
• 4.3 本章小结
• 5 海洋芽孢杆菌酯酶BSE-1 的催化动力学和热失活动力学研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 试剂和仪器
• 5.1.3 BSE-1 的活力测定
• 5.1.4 BSE-1 的催化反应动力学
• 5.1.5 BSE-1 的失活反应动力学
• 5.2 结果和讨论
• 5.2.1 BSE-1 的催化动力学研究
• 5.2.2 金属离子对BSE-1 动力学的影响
• 5.2.3 BSE-1 的热失活动力学
• 5.2.4 芽孢杆菌酯酶的动力学比较
• 5.3 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录