细胞分裂素调节拟南芥花发育基因表达的研究

论文摘要

细胞分裂素调节植物生长和发育的许多过程,如促进细胞分裂、影响开花时间、延缓叶的衰老以及控制顶端优势等。人们对拟南芥（Arabidopsis thaliana）花分生组织特征基因和花器官特征基因的功能以及光、温度等环境因素对花发育的调控作用已有较深入的研究。在拟南芥中,转基因表达pAP1:IPT4的研究结果显示,与野生型植株相比,转基因植株花序中的细胞分裂素含量显著提高,表现出花排列密集、花原基和花器官数目增多、顶端优势降低等表型（李兴国等,未发表资料）。为进一步阐明细胞分裂素对花发育的调控作用,我们主要利用原位杂交和GUS染色技术,对pAP1:IPT4转基因植株中花发育相关基因的表达模式进行了较详细的分析。原位杂交和GUS染色分析结果显示,在pAP1:IPT4转基因植株中,花分生组织特征决定基因LEAFY（LFY）的表达部位与野生型相比没有明显变化,但表达量显著提高。原位杂交结果同时显示,在pAP1:IPT4转基因植株中,花器官特征决定基因APETALA1（AP1）、PISTILLATA（PI）、AGAMOUS（AG）的表达量均有不同程度的提高。在转基因植株处于时期4的花中,AP1不仅在萼片原基中表达,在花中心的分生组织中亦有较多的mRNA积累,这与其在野生型植株中的表达模式有所不同。PI在转基因植株的花序分生组织和时期2的花中均有表达,随着花的进一步发育,PI的转录水平较野生型明显提高。AG在转基因植株的花原基中有较强的表达信号。当花发育至时期3和4时,AG在萼片原基内方分生组织中的mRNA水平比野生型明显增加,在萼片原基中也检测到AG的表达。我们推测转基因植株的表型可能与上述基因的表达变化具有一定的关系。对pAP1:IPT4转基因植株进行的全基因组表达谱分析发现,LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）基因家族成员LBD3的表达量受到上调。为了进一步探究LBD3的功能,我们构建了35S:LBD3和35S:anti-LBD3表达载体并转化野生型拟南芥。结果显示,35S:LBD3转基因植株主花序轴的顶端优势显著下降,而35S:anti-LBD3转基因植株未见明显的表型变化。RT-PCR的结果表明,在35S:LBD3转基因植株中,MORE AXILLARY GROWTH4（MAX4）表达量明显提高,MAX2的表达量则略有降低。MAX途径的下游基因BRANCHED1（BRC1）的表达量也有所上调。MAX途径通过抑制生长素的极性运输来抑制侧枝生长。LBD3与生长素极性运输以及侧枝发育相关基因的作用关系有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 拟南芥的生殖发育
• 1.1.1 拟南芥花分生组织的形成
• 1.1.2 拟南芥花器官的发育
• 1.2 细胞分裂素及其在植物生长发育中的作用
• 1.2.1 细胞分裂素的合成和代谢
• 1.2.2 细胞分裂素信号转导
• 1.2.3 细胞分裂素及其在植物生长发育过程中的作用
• 1.2.3.1 细胞分裂素参与了分生组织大小及干细胞的维持
• 1.2.3.2 细胞分裂素参与光信号转导
• 1.2.3.3 细胞分裂素参与维管束的分化
• 1.2.3.4 细胞分裂素影响叶绿体发育及叶片衰老
• 1.2.3.5 细胞分裂素参与顶端优势维持及侧枝发生
• 1.2.3.6 细胞分裂素对作物农艺性状的影响及在生产上的应用
• 1.3 激素对拟南芥花发育的影响
• 1.4 植物顶端优势形成及侧生器官发生的分子机制
• 1.5 LBD 基因家族及其功能
• 1.5.1 LBD 基因是个成员众多、进化保守的基因家族
• 1.5.2 LBD 基因表达模式和功能具有多样性
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及其生长条件
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 35S:LBD3 和35S:anti-LBD3 表达载体的构建
• 2.2.1.1 植物总 RNA 的提取
• 2.2.1.2 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.1.3 反转录产物质量的检测及 LBD3 基因克隆
• 2.2.1.4 连接反应
• 2.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.1.6 DNA 序列测定
• 2.2.1.7 目的基因片段和表达载体的连接
• 2.2.1.8 根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.1.9 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.1.10 转基因植株的分析
• 2.2.2 GUS 染色分析
• 2.2.2.1 植物材料的GUS 染色
• 2.2.2.2 GUS 染色材料石蜡切片
• 2.2.3 原位杂交
• 2.2.3.1 材料的固定
• 2.2.3.2 材料的包埋
• 2.2.3.3 切片
• 2.2.3.4 探针合成与标记
• 2.2.3.5 脱蜡、消化、乙酰化、杂交
• 2.2.3.6 洗片
• 2.2.3.7 检测
• 2.2.4 RT-PCR 分析
• 2.2.5 转基因植株的遗传杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 过表达 IPT4 对拟南芥花发育的影响
• 3.1.1 pAP1:IPT4 转基因植株表型
• 3.1.2 AP1 基因的表达模式
• 3.1.3 pAP1:IPT4 转基因植株中花分生组织特异基因LFY 和AP1 的表达上调
• 3.1.4 pP1::IPT4 促进花器官特征决定基因PI 和AG 的表达
• 3.2 LBD3 基因功能初步分析
• 3.2.1 35S:LBD3 转基因植株表型
• 3.2.2 RT-PCR 分析35S:LBD3 转基因植株表型
• 4 讨论
• 4.1 AP1启动子驱动AtIPT4在转基因拟南芥中表达促进花发育相关基因的表达
• 4.2 LBD3 可能参与顶端优势的建立
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢