羟基磷灰石纳米粒子抑制肝癌细胞增殖及其机理研究

论文摘要

纳米粒子由于其独特的纳米生物学效应，已成为目前肿瘤防治研究工作的热点。羟基磷灰石纳米粒子具有抗癌活性，又具有良好的生物相容性，因而在抗肝癌研究中，受到越来越多的关注。本文选用均匀沉淀法成功制备出粒径范围主要为44.6nm～86.8nm（HAP1）、301.6nm～1339.3nm（HAP2）、843.2nm～2443.0nm（HAP3）三种羟基磷灰石粒子。用0.14mmol／L、0.28mmol／L、0.56mmol／L的HAP1纳米粒子以及0.56mmol／L浓度的HAP2和HAP3粒子与肝癌细胞作用，通过光镜观察和MTT法、生长曲线及集落形成率定量测定，结果显示HAP1纳米粒子对肝癌细胞的增殖能力有剂量和时间依赖性抑制作用，以0.56 mmol／L浓度处理肝癌细胞4d可达到显著的抑制作用；而0.56 mmol／L浓度的HAP2和HAP3粒子对肝癌细胞的作用都很弱。由此推断HAP1纳米粒子的抑制肝癌细胞增殖作用与粒径、浓度及作用时间有关，这为其体内外抗癌研究提供了依据。通过三种不同粒径的HAP粒子与肝癌细胞相互作用，经形态学观察与分析可知HAP1纳米粒子很容易与肝癌细胞膜结合，肝癌细胞以非网格蛋白介导的细胞膜穴样内陷途径胞吞HAP1纳米粒子进入肝癌细胞，而HAP2和HAP3粒子不易与肝癌细胞膜结合，因而很少进入肝癌细胞。通过Fluo-3荧光探针标记细胞内游离Ca2+，经荧光显微镜观察，HAP1纳米粒子使肝癌细胞的荧光增强，这说明HAP1纳米粒子进入肝癌细胞后，胞浆成份促进其降解。通过Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫细胞化学PCNA染色，光镜观察以及图像分析软件的定量测定，HAP1纳米粒子使肝癌细胞的平均细胞核DNA含量下降、核仁内AgNOR数量减少以及PCNA表达减弱，从分子生物学角度证实了HAP1纳米粒子体外抑制肝癌细胞的作用，同时也揭示了HAP1纳米粒子的抑癌机理①通过抑制DNA合成，主要是通过抑制DNA合成过程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干扰DNA的合成；②通过抑制rDNA的转录活性，抑制rRNA的合成，进一步抑制细胞内蛋白质的合成；③通过抑制PCNA的活性，影响细胞增殖周期的顺利进行，延长细胞增殖时间。流式细胞术检测结果也证实肝癌细胞被阻滞于增殖周期的G1期。通过形态学观察以及定量测试方法，可知HAP1纳米粒子体外抗肝癌作用缓慢，并不能快速杀死肝癌细胞，而首先是作为一种抑制肝癌细胞增殖作用的药物，通过逐渐影响其功能，最终导致细胞死亡。推测HAP1纳米粒子是通过其降解产物以及粒子本身共同影响细胞的功能，表现出肝癌细胞由局部到整体的超微结构变化，最终诱导肝癌细胞以非程序性死亡的方式死亡—胀亡。成功建立了符合肝癌形态学特征的人肝癌裸鼠移植瘤模型，采用瘤内局部注射途径，HAP1纳米粒子能明显抑制肝癌移植瘤生长，治疗1周和2周的抑瘤率分别为77.21％和51.32％。能明显延长荷瘤鼠的生存时间。对肝癌移植瘤组织做石蜡切片，Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫组织化学PCNA染色，通过光镜观察和图像分析软件定量测定，HAP1纳米粒子使移植瘤组织肝癌细胞的平均核DNA含量下降、核仁内AgNOR数量减少以及PCNA表达减弱，从分子生物学角度证实HAP1纳米粒子能明显抑制移植瘤的肝癌细胞增殖，同时也揭示了抑制机理。通过电镜观察发现移植瘤组织的肝癌细胞内有HAP1纳米粒子，推测其与进入体外培养肝癌细胞的方式相同，并在胞质内降解，可能同样是以降解产物及粒子本身影响细胞的功能，最终导致移植瘤组织的肝癌细胞死亡。由于体内是实体瘤组织，HAP1纳米粒子在肝癌组织的浓度高低分布不同，诱导肝癌细胞以程序性以及非程序性两种方式死亡—凋亡及胞体割裂。总之，HAP1纳米粒子体内抗肝癌的机理是：首先，①抑制肝癌细胞增殖，通过抑制DNA合成，主要是抑制DNA合成过程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干扰DNA的合成。通过抑制rDNA的转录活性，抑制rRNA的合成，进一步抑制蛋白质的合成。通过抑制PCNA的活性，阻滞细胞增殖周期。最终起到明显抑制肝癌细胞增殖的作用；②可能也具有诱导肝癌细胞分化的作用；③肝癌细胞被诱导以凋亡和胞体割裂两种方式死亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 纳米技术在肿瘤诊断和治疗中的应用
• 1.1.1 纳米技术与肿瘤诊断
• 1.1.2 纳米技术与肿瘤治疗
• 1.2 纳米羟基磷灰石在生物医学领域中的应用
• 1.2.1 人工骨
• 1.2.2 药物载体
• 1.2.3 纳米羟基磷灰石抗癌活性
• 1.3 肝癌治疗研究现状
• 1.3.1 外科切除
• 1.3.2 肝移植
• 1.3.3 放射治疗
• 1.3.4 系统化疗
• 1.3.5 介入治疗
• 1.3.6 生物治疗
• 1.3.7 中医治疗
• 1.4 论文研究的意义及主要研究内容
• 第二章 羟基磷灰石粒子的制备和表征
• 2.1 引言
• 2.2 化学试剂和仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 HAP粒子的制备
• 2.3.2 HAP粒子的性能测试
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 样品的粒径及分布趋势分析
• 2吸附法测定样品的比表面积'>2.4.2 N₂吸附法测定样品的比表面积
• 2.4.3 TEM观察样品形貌
• 2.5 本章小结
• 第三章 羟基磷灰石粒子对肝癌细胞增殖的抑制作用
• 3.1 引言
• 3.2 试剂和仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞与材料
• 3.3.2 不同浓度HAP纳米粒子对肝癌细胞的作用
• 3.3.3 大粒径HAP粒子对肝癌细胞的作用
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 HAP纳米粒子对肝癌细胞光镜结构的影响
• 3.4.2 HAP纳米粒子对肝癌细胞增殖的抑制作用
• 3.4.3 HAP纳米粒子对肝癌细胞生长增殖的影响
• 3.4.4 HAP纳米粒子对肝癌细胞集落形成的影响
• 3.4.5 大粒径HAP粒子对肝癌细胞光镜结构的影响
• 3.4.6 大粒径HAP粒子对肝癌细胞生长增殖的影响
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第四章 羟基磷灰石纳米粒子与肝癌细胞的相互作用
• 4.1 引言
• 4.2 试剂和仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 HAP纳米粒子与肝癌细胞的吸附作用
• 4.3.2 HAP纳米粒子与肝癌细胞的相互影响
• 2+的变化'>4.3.3 荧光显微镜观察肝癌细胞内Ca²⁺的变化
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 HAP纳米粒子与肝癌细胞膜的影响
• 4.4.2 HAP纳米粒子与肝癌细胞膜结合
• 4.4.3 肝癌细胞内吞HAP纳米粒子
• 4.4.4 肝癌细胞对胞内HAP纳米粒子的作用
• 4.4.5 HAP纳米粒子对肝癌细胞的影响
• 2+的影响'>4.4.6 HAP纳米粒子对肝癌细胞内Ca²⁺的影响
• 4.5 讨论
• 4.5.1 HAP纳米粒子易与肝癌细胞膜结合
• 4.5.2 HAP纳米粒子进入肝癌细胞的方式
• 4.5.3 HAP纳米粒子在肝癌细胞内降解
• 4.5.4 HAP纳米粒子对肝癌细胞的早期作用
• 4.6 本章小结
• 第五章 羟基磷灰石纳米粒子体外抑制肝癌细胞增殖的机理初探
• 5.1 引言
• 5.2 试剂和仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 DNA含量测定
• 5.3.2 核仁组成区嗜银蛋白测定
• 5.3.3 增殖细胞核抗原测定
• 5.3.4 流式细胞仪检测
• 5.3.5 透射电镜观察
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 HAP纳米粒子对肝癌细胞核DNA含量的影响
• 5.4.2 HAP纳米粒子对肝癌细胞AgNOR数量的影响
• 5.4.3 HAP纳米粒子对肝癌细胞PCNA表达的影响
• 5.4.4 HAP纳米粒子对肝癌细胞周期时相的影响
• 5.4.5 HAP纳米粒子对肝癌细胞超微结构的影响
• 5.5 讨论
• 5.5.1 HAP纳米粒子抑制肝癌细胞核DNA的合成
• 5.5.2 HAP纳米粒子抑制肝癌细胞rRNA的形成
• 5.5.3 HAP纳米粒子抑制肝癌细胞PCNA的表达
• 5.5.4 HAP纳米粒子影响肝癌细胞的增殖周期
• 5.5.5 HAP纳米粒子影响肝癌细胞的功能
• 5.5.6 肝癌细胞的死亡方式
• 5.6 本章小结
• 第六章 肝癌模型的建立及羟基磷灰石纳米粒子的抑癌疗效观察
• 6.1 引言
• 6.2 试剂和仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 细胞与动物
• 6.3.2 建立人肝癌裸鼠移植瘤模型
• 6.3.3 人肝癌裸鼠移植瘤模型的病理检查
• 6.3.4 HAP纳米粒子对肝癌模型的局部注射治疗
• 6.3.5 HAP纳米粒子对肝癌模型的疗效评价
• 6.3.6 统计方法
• 6.4 实验结果
• 6.4.1 裸鼠人肝癌模型的建立
• 6.4.2 HAP纳米粒子对肝癌移植瘤生长的抑制作用
• 6.4.3 HAP纳米粒子对肝癌移植瘤组织结构的影响
• 6.4.4 HAP纳米粒子对荷瘤鼠生存期的影响
• 6.5 讨论
• 6.6 本章小结
• 第七章 羟基磷灰石纳米粒子体内抗肝癌细胞增殖的机理初探
• 7.1 引言
• 7.2 试剂和仪器
• 7.3 实验方法
• 7.3.1 DNA含量测定
• 7.3.2 核仁组成区嗜银蛋白测定
• 7.3.3 增殖细胞核抗原测定
• 7.3.4 透射电镜观察
• 7.4 实验结果
• 7.4.1 HAP纳米粒子对体内肝癌细胞核DNA含量的影响
• 7.4.2 HAP纳米粒子对体内肝癌细胞AgNOR含量的影响
• 7.4.3 HAP纳米粒子对体内肝癌细胞PCNA表达的影响
• 7.4.4 HAP纳米粒子对肝癌组织超微结构的影响
• 7.5 讨论
• 7.5.1 HAP纳米粒子抑制肝癌细胞增殖机理
• 7.5.2 HAP纳米粒子可能诱导肝癌细胞分化
• 7.5.3 肝癌组织及肝癌细胞超微结构变化
• 7.5.4 体内肝癌细胞的死亡方式
• 7.6 本章小结
• 第八章 结论
• 参考文献
• 缩写词表
• 发表论文
• 致谢