马来酸酐类化合物对蛋白磷酸酶的抑制动力学及抑制机制研究

论文摘要

蛋白磷酸酶（protein phosphatase, EC3.1.3.16）是一类催化蛋白质磷酸酯键水解的酶,调控多种细胞生物学过程,被广泛用于各个生化领域。变构霉素是一种具有极强蛋白磷酸酶抑制活性的马来酸酐类化合物,据报道半抑制率仅为0.7nmol/L。鉴于马来酸酐类化合物良好的抑菌活性,研究其对蛋白磷酸酶的抑制动力学及抑制机制,考察此类天然化合物作为蛋白磷酸酶抑制剂,控制病原菌生长、促进病原细胞凋亡,从而应用成为生物源农药的可行性。本文旨从植物病原丝状真菌Botrytis cinerea中提取蛋白磷酸酶,分离纯化后研究其酶学性质。以纯化的蛋白磷酸酶为靶标,进行马来酸酐类化合物的抑制机制及抑制动力学研究。将发酵优化后的B. cinerea菌体通过超声破碎、硫酸铵分级盐析、透析浓缩、DEAE-Sepharase离子交换层析、真空冷冻干燥等步骤,获得SDS-PAGE单一条带蛋白磷酸酶。该酶纯化倍数为30.69倍,酶活回收率达39.26%。酶学特性研究结果表明,其最适反应pH为4.0,最适反应温度为37℃。该酶在pH3.0-6.0，50℃以下稳定。考察金属离子对B. cinerea蛋白磷酸酶酶活的影响,发现Mg2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+能提高该酶活性,Zn2+、Cu2+、Mn2+对酶活有抑制作用。以p-NPP为底物的酶动力学参数Vmax和Km分别为12.71mmol/L·min-1与12.84mmol/L、研究了马来酸酐类化合物对B. cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用,结果表明,每种化合物对蛋白磷酸酶抑制活性都不同,7种马来酸酐类化合物变构霉素,4,5-二氯邻苯二甲酸酐,苯基马来酸酐,二氯马来酸酐,四溴邻苯二甲酸酐,二甲基马来酸酐,四氯邻苯二甲酸酐有良好的酶抑制活性,对应的IC50分别是0.57mmol/L,4.98mmol/L,5.85mmol/L,6.64mmol/L,8.43mmol/L,10.11mmol/L,14.5mmol/L。进一步实验表明,抑制效果最佳的变构霉素与二氯马来酸酐、四氯邻苯二甲酸酐、四溴邻苯二甲酸酐对蛋白磷酸酶的抑制机理均为不可逆抑制。浓度和时间都会影响马来酸酐类化合物对蛋白磷酸酶的抑制作用。二甲基马来酸酐和变构霉素作为蛋白磷酸酶抑制剂处理番茄叶片后可以完全防治B. cinerea菌丝的生长,对灰霉病有良好疗效。结果表明,以蛋白磷酸酶为靶标,筛选马来酸酐类化合物作为生物源农药抑制灰霉病有效可行。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 蛋白磷酸酶及其抑制剂国内外研究进展
• 1.2.1 蛋白磷酸酶研究进展
• 1.2.2 丝/苏氨酸蛋白磷酸酶1和2A主要抑制剂及抑制机理
• 1.3 本论文的研究背景、内容及意义
• 参考文献
• 第二章 蛋白磷酸酶的分离纯化研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要实验仪器
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 菌种及培养方法
• 2.1.4 B.cinerea蛋白磷酸酶酶活测定方法
• 2.1.5 B.cinerea蛋白磷酸酶蛋白含量测定方法
• 2.1.6 提取B.cinerea蛋白磷酸酶粗酶
• 2.1.7 最适硫酸铵分级盐析饱和度选择
• 2.1.8 透析脱盐
• 2.1.9 真空冷冻干燥
• 2.1.10 阴离子交换层析
• 2.1.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 酶反应产物标准曲线
• 2.2.2 蛋白质浓度标准曲线
• 2.2.3 最适硫酸铵分级盐析饱和度选择
• 2.2.4 阴离子交换层析结果
• 2.2.5 真空冷冻干燥结果
• 2.2.6 SDS-PAGE电泳图
• 2.2.7 B.cinerea蛋白磷酸酶分离纯化结果
• 2.3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 蛋白磷酸酶酶学性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验器材
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 B.cinerea蛋白磷酸酶的酶活力及蛋白质含量测定方法
• 3.1.4 B.cinerea蛋白磷酸酶酶学性质研究方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 不同pH缓冲液对B.cinerea蛋白磷酸酶酶活力的影响
• 3.2.2 B.cinerea蛋白磷酸酶pH稳定性
• 3.2.3 反应温度对B.cinerea蛋白磷酸酶酶活力的影响
• 3.2.4 B.cinerea蛋白磷酸酶酶活热稳定性影响
• 3.2.5 金属离子对B.cinerea蛋白磷酸酶活力影响
• 3.2.6 B.cinerea蛋白磷酸酶酶促反应动力学参数测定
• 3.3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 马来酸酐类化合物对蛋白磷酸酶抑制动力学及抑制机制研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验器材
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 B.cinerea蛋白磷酸酶的酶活力及蛋白质含量测定方法
• 4.1.4 马来酸酐类化合物对B.cinerea蛋白磷酸酶抑制动力学及抑制机制研究
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 马来酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用及抑制动力学研究
• 4.2.2 4,5-二氯邻苯二甲酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶抑制作用及动力学研究
• 4.2.3 4-甲基邻苯二甲酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶的影响
• 4.2.4 二甲基马来酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶抑制作用
• 4.2.5 苯基马来酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶抑制作用
• 4.2.6 变构霉素对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制动力学及抑制机制研究
• 4.2.7 二氯马来酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制动力学及抑制机制研究
• 4.2.8 四氯邻苯二甲酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制动力学及抑制机制研究
• 4.2.9 四溴邻苯二甲酸酐对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用及抑制机制研究
• 4.3 本章小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文