基于分子探针的肿瘤细胞p53 mRNA定量检测及点突变检测研究

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一,越来越多的研究表明恶性肿瘤发生过程与细胞内相关基因表达水平的改变具有密切联系。因此,建立快速、准确、灵敏检测基因表达水平的方法,对于肿瘤的发病机理研究、早期诊断和治疗具有重要意义。本论文设计了具有特异识别功能的荧光分子探针,发展了在基因水平上定量研究肿瘤细胞p53 mRNA表达与点突变检测的体系,主要开展了以下三方面的研究工作:1、根据p53抑瘤基因的碱基序列,设计了能特异性检测p53 mRNA的分子信标（molecular beacon,MB）,发展了一种快速定量测定细胞内总RNA提取物中p53 mRNA的方法。采用鼻咽癌细胞系（CNE2）和经RNA干扰技术降低p53基因表达的细胞系（CNE2-p53RNAi）为样本,抽提其总RNA并用MB检测。建立了p53/cDNA标准曲线,将其应用于多种肿瘤细胞内p53基因表达水平的分析,表达变化趋势与经典的mRNA分析方法RT-PCR检测结果相符。这种方法简单、灵敏、快速、安全,可以用于不同细胞中p53 mRNA的体外定量检测。2、根据已建立的分子信标定量检测p53 mRNA的方法,考察了用5-氟尿嘧啶（5-FU）作用不同时间后肺腺癌细胞（A549）中p53 mRNA表达水平的变化,并结合传统分子生物学方法研究该基因转录水平变化对细胞增殖的影响及可能机制,验证了分子信标快速检测mRNA方法的可靠性和实用性。结果表明:药物作用后能诱导A549细胞中p53 mRNA表达上调,且作用6小时后p53 mRNA表达最高,但随着药物作用时间的进一步增加,p53 mRNA表达降低。该方法快速、准确、成本低,能够快速地获知该药物对细胞内p53 mRNA表达影响的信息,有望为肿瘤的个体化治疗快速、准确地提供合理用药的参考依据。3、根据p53基因的碱基序列设计荧光基团四甲基罗丹明标记的核酸探针（荧光探针）和熄灭基团4’-（4’-二甲基氨基叠氮苯）苯甲酸标记的核酸探针（熄灭探针）,基于荧光共振能量转移原理和RNaseH能降解RNA与DNA杂交体中RNA模板这一特点,发展了一种直接对RNA模板进行点突变检测的新方法。在此基础上,对肿瘤细胞抽提物中p53 mRNA进行点突变检测,检测结果与基因测序结果相符。这种方法简单、快速、安全,能够广泛应用于不同细胞中p53 mRNA点突变的检测。

论文目录

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• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩写词表
• 第1章 绪论
• 1.1 p53 基因的研究进展
• 1.1.1 p53 基因的结构
• 1.1.2 p53 基因与肿瘤的发生
• 1.2 检测mRNA 的常用方法
• 1.2.1 RT-PCR 方法
• 1.2.2 实时荧光定量PCR 方法
• 1.2.3 传统核酸探针法
• 1.2.4 基因芯片方法
• 1.3 荧光共振能量转移探针在核酸研究中的应用
• 1.3.1 TaqMan 探针
• 1.3.2 相邻探针
• 1.3.3 分子信标
• 1.4 本文拟开展的工作
• 第2章 分子信标用于p53 mRNA 的体外定量检测
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验原理
• 2.2.2 试剂和仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 p53 分子信标性能的验证
• 2.3.2 cDNA/p53MB 标准曲线的建立
• 2.3.3 p53 分子信标定量检测肿瘤细胞中p53 m RNA 表达水平
• 2.3.4 RT-PCR 法验证p53 信标检测方法的准确性
• 2.3.5 标准加入回收率实验
• 2.4 小结
• 第3章 分子信标在5-氟尿嘧啶对人肺腺癌细胞作用机理研究中的应用
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 MTT 法测定细胞对5-FU 的敏感性
• 3.3.2 p53 分子信标定量检测肿瘤细胞中p53 m RNA 表达水平
• 3.3.3 RT-PCR 法验证p53 信标检测方法的准确性
• 3.3.4 Hoechst 33258 荧光染色检测5-FU 诱导的细胞凋亡
• 3.3.5 流式细胞术考察5-FU 处理以后细胞周期和细胞凋亡情况
• 3.3.6 5-FU 促进细胞中抑癌蛋白表达水平并抑制原癌蛋白表达水平
• 3.4 小结
• 第4章 基于荧光共振能量转移探针对p53 m RNA 点突变的检测
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验原理
• 4.2.2 试剂和仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 DNA 模板体外转录成RNA
• 4.3.2 模板 RNA 中p53 RNA 点突变的检测
• 4.3.3 细胞总RNA 中p53 m RNA 点突变的检测
• 4.3.4 测序
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢