HER2靶向重组型Caspase-6融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用

论文摘要

骨肉瘤是一种最常见的原发性恶性骨肿瘤,好发于长骨的干骺端,一般累及12-25岁之间的患者。其突出的特点是转移早,在临床做出骨肉瘤诊断时,已有80%的患者发生了肺转移。近25年中,骨肉瘤的治疗有了长足的进展,近80%患者能保留病肢,且5年生存率由20%左右提高到近80%,但仍有半数以上的患者死于骨肉瘤的转移和复发。近十年来基因治疗的兴起、肿瘤的免疫治疗和分子靶向治疗为骨肉瘤的治疗开辟了新的治疗途径。探索新的有效的治疗方法已成为骨肉瘤研究的重要方向。我们通过成功构建的HER2靶向重组型Caspase-6融合蛋白瞬时转染骨肉瘤SOSP-9607细胞,体内、外实验检测其促肿瘤凋亡的活性。Caspase-6,又名为mch2,是Caspases家簇的一员,属于效应Caspase分子。Caspase-6基因编码一种34kDa、与CPP32（即Caspase-3）,Ich1/Nedd2和IL-1β等高度同源的蛋白,是哺乳动物细胞中介导凋亡的重要分子,也是哺乳动物细胞凋亡的执行分子之一。将Caspase-6基因的大小亚基进行重排,可以得到一个具有与天然活性Caspase-6分子晶体结构非常相似的分子,该分子具有天然Caspase-6的活性,可以作为CrmA和Bcl-2作用的下游分子,也能识别并切割PARP和lamin A等底物,执行细胞凋亡的功能。HER2/neu分子是癌基因erbB2的编码产物,其编码基因定位于人染色体17q21,是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白,是表皮生长因子（EGF）受体家族的成员之一。通常情况下,HER2/neu只在胎儿时期表达,到成年以后,仅有低水平表达于细胞表面。HER2/neu的过度表达存在于多种肿瘤组织,如转移性乳腺癌（25%-30%）、炎症性乳腺癌（50%）、转移性导管癌（60-70%）、非小细胞肺癌（13-55%）、卵巢癌（18-43%）、子宫内膜癌（10-52%）、直肠结肠癌（33-85%）、肾癌（22-36%）、宫颈癌（16-50%）、胃癌（21-64%）、食道癌（10-26%）、前列腺癌（5-46%）、骨肉瘤（40-44%）及成骨肉瘤肺转移（58%）等,成为一种公认的肿瘤标志物。本研究将信号肽、单链抗体、来源于绿脓杆菌的具有膜转位作用的肽段和重组的Caspase-6融合,构建成一种分泌型靶向促凋亡融合蛋白Immunocasp-6（e23sFv-PEⅡ（253-364）- Caspase-6）,使其能特异性识别、内化并转位进入细胞中,诱导HER2阳性的肿瘤细胞凋亡。首先我们将immunocasp-6融合蛋白亚克隆入真核表达载体pCMV中,构建成一种pCMV- e23sFv-PEⅡ（253-364）- Caspase-6载体（下文简称pCMV-6）,采用阳离子脂质体法将pCMV-6转染入骨肉瘤SOSP-9607细胞系中,通过间接免疫荧光法、流式细胞术及透射电镜检测等方法,对immunocasp-6的促凋亡活性进行了检测。实验结果表明该融合蛋白在骨肉瘤SOSP-9607细胞中能够表达;转染pCMV-6的实验组细胞变得稀少,体积缩小且核固缩,进一步透射电镜观察发现细胞膜出泡,细胞核浓缩,染色质聚集等典型凋亡特征,而转染pCMV-e23sFv-PEⅡ（253-364） （下文简称pCMV）的对照组肿瘤细胞形态正常,细胞结构完整;MTT法检测到实验组肿瘤细胞生长明显慢于对照组肿瘤细胞,流式细胞术进一步检测发现实验组细胞的凋亡率为31.4%,而对照组为6%。接着我们在活体上验证了immunocasp-6对骨肉瘤的抑瘤效果。将荷瘤裸鼠完全随机分组,阳离子脂质体包裹法将pCMV-6和pCMV分别肌肉注射入裸鼠身上,观察到实验组瘤体生长明显慢于对照组;HE染色、TUNEL染色检测证明实验组肿瘤细胞呈现出典型的凋亡特征,而对照组肿瘤细胞结构正常;以抗Caspase-6的抗体进行免疫组织化学染色,结果显示肿瘤组织为Caspase-6阳性,而其他组织中如肌肉等染色呈Caspase-6阴性。体外、体内实验结果表明:immunocasp-6能特异性识别、结合骨肉瘤SOSP-9607细胞表面的HER2抗原,被内吞入细胞后,对细胞底物进行识别、切割,执行促凋亡的功能,而对于HER2阴性的其他组织无杀伤及损伤作用。因此,我们构建的immunocasp-6融合蛋白中e23sFv部分仍然保持了其对HER2阳性肿瘤细胞的靶向性识别和结合能力,同样与抗体融合后的重组型Caspase-6的杀伤活性也不受到影响。综上所述,immunocasp-6可以靶向性识别、结合并杀伤HER2阳性的骨肉瘤细胞,为骨肉瘤的基因治疗提供了一定的实验基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献回顾
• 1 骨肉瘤基因治疗的研究进展
• 2 以HER2／neu 为靶点抗肿瘤治疗研究进展
• 3 Caspases 及Caspase-6 的研究进展
• 4 PE 分子结构和功能
• 5 阳离子脂质体在基因治疗中的应用
• 前言
• 正文
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 个人简历与研究成果
• 致谢