Nisin发酵条件的优化及代谢调控

论文摘要

乳链菌肽（Nisin）是一种天然食品防腐剂,能够抑制许多革兰氏阳性致病菌的生长。是唯一一种允许商业化生产的天然食品防腐剂。目前,我国只有少数企业生产Nisin,且产量与纯度都远低于国外同类产品,本论文旨在通过优化发酵条件和代谢调控的手段提高Nisin的产量,并通过分析了解Nisin代谢过程的调控机制。本研究通过从五种乳酸菌发酵培养基中选出CM培养基作为初始发酵培养进行优化,在此基础上摸索出了Nisin发酵生产的最适初始pH为7.0,最适种量为3%,最佳接种种龄为12h。随后,本研究从营养调控、氨基酸代谢调控和乳酸的反馈调控三种手段对Nisin的代谢进行了调控。营养调控通过单因素的摸索,决定在CM培养基的基础上添加玉米浆作为补充氮源,磷酸二氢钾作为磷源进行发酵。然后利用Plackett-Burman试验确定影响Nisin效价的三个主要因素为蔗糖、酵母膏和磷酸二氢钾的浓度,并使用Box-Behnken试验分析方法确定了三个主要因素最佳发酵浓度分别为39g/L、18.5g/L和20.5g/L。优化后的培养基发酵生产Nisin的效价为1687±5IU,提高了740IU/mL。氨基酸的调控通过分析得出Arg、Cys、Trp对Nisin的生产有正调控作用,添加1g/L的这三种氨基酸分别使Nisin的效价提高了224±5IU/mL,130±5IU/mL、118±5IU/mL,而1g/L的Pro对Nisin的合成有负调控作用使Nisin效价降低了138±5IU/mL。Lactococcus lactis在延滞期大量利用游离态的氨基酸,进入对数生长期后主要利用分解蛋白质产生的氮源。试验证明Lactococcus lactis利用的主要靠从周围环境中吸收Arg,而不依赖自身合成。在Nisin代谢过程中精氨酸的消耗量最大,随Arg添加量的增加Nisin的产量不断增加,但增加幅度降低,当精氨酸添加量高于8g/L时,Nisin产量基本不再增长,此时效价增加了450IU/mL。最后本试验研究了乳酸的反馈调控,计算得出发酵过程中蔗糖代谢转化为乳酸的转化率为83.3%。经验证,乳酸的抑制作用一方面来自于pH的下降,另一方面来自于乳酸根的累积。通过流加5M NaOH控制发酵液pH为7.0左右时,使Nisin发酵产量在优化的培养基的基础上又提高420±5IU/mL。而当发酵液中乳酸根的含量达到7%时Nisin停止生产并由此推断出乳酸根的积累是补糖发酵的限制性因素。经过以上培养条件的优化和代谢调控过程之后,Nisin的效价共提高了近1410IU/mL,约为未进行调控时的1.5倍。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 Nisin 的简介
• 1.1.1 Nisin 的发现
• 1.1.2 Nisin 的结构
• 1.1.3 Nisin 形成的分子机制
• 1.1.4 Nisin 的性质
• 1.2 Nisin 的应用
• 1.3 Nisin 的国内外需求
• 1.4 Nisin发酵生产的研究现状
• 1.4.1 Nisin代谢的动力学模型
• 1.4.2 培养条件对 Nisin 发酵的影响
• 1.5 微生物的代谢调控
• 1.5.1 营养调控
• 1.5.2 诱导调控
• 1.5.3 反馈调控
• 1.6 本课题研究的目的意义及主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要药品和试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 分析方法
• 2.2.2 发酵条件的优化方法
• 2.2.3 代谢调控的研究方法
• 第3章 结果与分析
• 3.1 发酵培养基的选择
• 3.1.1 各发酵液中 Lactococcus lactis 的生长曲线
• 3.1.2 各发酵液中pH 变化曲线
• 3.1.3 各发酵液中 Nisin 效价曲线的测定
• 3.2 培养条件的优化
• 3.2.1 培养基初始pH 对 Nisin 效价的影响
• 3.2.2 接种种龄对 Nisin 产量的影响
• 3.2.3 接种量对 Nisin 效价的影响
• 3.3 代谢调控
• 3.3.1 营养调控
• 3.3.2 氨基酸对 Nisin 的调控作用
• 3.3.3 乳酸的反馈调控
• 3.3.4 Nisin代谢调控的结果
• 第4章 讨论
• 4.1 碳、氮、磷营养调控的理论基础
• 4.2 Nisin代谢过程中诱导调控的理论基础及现实意义
• 4.3 乳酸反馈调控研究对补料发酵的指导意义
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢