论文摘要
【目的】肿瘤基因治疗的关键是载体的选择,慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体,它对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力,能够整合到宿主细胞的基因组中,可以在体内长期稳定表达,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点。本研究采用慢病毒作为载体,构建小鼠趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重组慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达,为双基因治疗淋巴瘤的实验研究奠定基础。【方法】1.第一部分,自行设计引物合成小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,采用巢式PCR扩增目的基因,使用Age I酶对慢病毒载体进行酶切消化,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析,测序结果与目标基因序列完全一致的即为构建成功的目的基因质粒。然后将构建好的目的基因质粒进行超纯去内毒素抽提。2.第二部分,MIP-1α和B7-1目的基因质粒分别转染293T细胞,48小时后,观察荧光报告基因的绿色荧光蛋白（GFP）表达,并采用Western Blot法检测目的基因质粒在293T细胞中的表达。3.第三部分,采用pGC-LV重组慢病毒载体和包装质粒pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体组成的三质粒系统,共转染293T细胞,培养48 h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩和纯化得到高滴度的慢病毒浓缩液。取10μl慢病毒浓缩液转染293T细胞,提取总RNA,逆转录获得cDNA,应用实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。【结果】1.成功构建小鼠趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重组慢病毒载体,目的基因测序结果与目标序列完全一致。2. MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞后,均可观察到荧光报告基因的绿色荧光蛋白表达,Western Blot法成功检测到MIP-1α、B7-1目的基因质粒在293T细胞中表达。3.三质粒系统成功共转染293T细胞,包装出高滴度的MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒浓缩液,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/ml。【结论】本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤双基因治疗的实验研究奠定了基础。