Kocuria sp.3-3来源木聚糖酶基因筛选、克隆、表达、性质研究及定点突变研究

论文摘要

木聚糖是半纤维素的主要组成部分,是自然界中第二大生物质资源。木聚糖酶是指将木聚糖水解成低聚木糖或木糖的酶系总称,其中内切p-1,4-D-木聚糖酶[EC 3.2.1.8]是其中最关键的酶。木聚糖酶在饲料、食品、造纸和纺织等领域都有广泛的应用前景。近年来,随着酶法造纸术的发展,碱性木聚糖酶引起了人们木聚糖酶的高度关注。本研究基于已经得到的一株能够产碱性木聚糖酶的放线菌,通过构建该菌株的基因组文库,筛选出木聚糖酶基因,明确了基因的结构,并将其在大肠杆菌表达系统中进行表达。在对酶进行纯化后,深入研究了该酶的酶学性质。1)对3-3进行菌种鉴定,包括形态观察、生理生化检测和系统发育树分析,确定菌株的分类；2)提取3-3的基因组DNA,对基因组DNA进行酶切,将4-9 kb范围内的酶切片段与载体相连并转化入大肠杆菌感受态中,从而构建了3-3的基因组文库,并筛选获得了1个含木聚糖酶基因Kxg的阳性转化子X-27,经测序后确定了Kxg的序列,从而得到了木聚糖酶Kxp的序列。对Kxp一系列的分析结果表明,Kxp含有389个氨基酸残基,分子量为43806.4,属于F/10家族糖苷水解酶。3)根据Kxg序列设计引物,以X-27提取的质粒为模板,进行PCR扩增得到木聚糖酶基因Kxg。将Kxg以正确的阅读框架连接到大肠杆菌表达载体pET-Duet上,并转化入E.coli rosetta,获得重组工程菌R32。经过IPTG诱导,在培养基上清液中得到了Kxp。4)采用离子交换和亲和层析的方法对得到的Kxp粗酶液进行纯化,经过两步纯化后,得到了纯度很高的终产物。对Kxp进行酶学性质分析,酶Km和Vmax分别为5.41mg/mL和202.3μmol·min-1·mg-1。Kxp的最适反应pH为8.5,在pH7-10之间保持最高活力的50%以上。Kxp具有很好的pH稳定性,在pH8-11内4℃过夜放置后,酶活残留仍在80%以上。Kxp的最适反应温度为55℃,在反应温度低于40℃C或高于60℃C时酶活性较低。Kxp具有良好的热稳定性,70℃C处理1h后酶活仍有30%残留。在反应体系中加入5 mM的各种金属离子或化合物,观察其对酶活的影响,结果表明酶活受重金属离子影响较大,而轻金属离子对酶活几乎没有影响。5)对木聚糖酶Kxp的H131、W135、E176、N179、H259、E288、W332、W340和H102等位点进行定点突变,并对各突变蛋白的性质进行初步研究。结果表明,前八个位点对于维持酶活具有重要作用,而H131、W135和H259也对酶和底物的结合起一定作用。为提高木聚糖酶Kxp的热稳定性,将H102用Cys残基替代。对突变蛋白KxpH102C的热稳定性研究结果表明,突变蛋白的热稳定性较之Kxp并未有提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 木聚糖结构
• 1.2 木聚糖酶
• 1.2.1 木聚糖酶定义
• 1.2.2 木聚糖酶的结构
• 1.2.3 木聚糖酶的分类
• 1.2.4 木聚糖酶理化性质
• 1.2.5 木聚糖酶催化机制
• 1.2.6 木聚糖酶的基因工程研究
• 1.2.7 木聚糖酶基因的定点突变
• 1.2.8 木聚糖酶的应用
• 1.3 立题依据和研究意义
• 第二章 Kocuria sp.3-3的鉴定及其木聚糖酶的纯化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 主要药品和试剂
• 2.1.3 实验菌株
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 菌株形态观察
• 2.1.6 基因组DNA提取
• 2.1.7 16S rDNA扩增
• 2.1.8 16S rDNA测序及系统发育学分析
• 2.1.9 菌株生理特征鉴定
• 2.1.10 菌株生化特征鉴定
• 2.1.11 木糖标准曲线的制作
• 2.1.12 木聚糖酶酶活检测
• 2.1.13 Kxp粗酶液的制备
• 2.1.14 Kxp的纯化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌株形态观察
• 2.2.2 菌株生理生化特征检测及比对
• 2.2.3 菌株16S rDNA测序及系统发育学分析
• 2.2.4 木糖标准曲线的制作
• 2.2.5 Kxp粗酶液的制备
• 2.2.6 Kxp粗酶液的纯化
• 本章小结
• 第三章 Kocuria sp.3-3基因组文库的构建和木聚糖酶基因Kxg的筛选
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 药品和试剂
• 3.1.3 菌株和质粒
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 3-3 Kocuria sp.3-3基因组DNA提取
• 3.1.6 基因组的酶切
• 3.1.7 酶切片段切胶回收
• 3.1.8 感受态细胞制备
• 3.1.9 菌株基因组文库的构建
• 3.1.10 Kocuria sp.3-3基因组文库质量的鉴定
• 3.1.11 含目的基因的阳性转化子的筛选
• 3.1.12 木聚糖酶DNA序列测定
• 3.1.13 3-3木聚糖酶分析
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 Kocuria sp.3-3基因组DNA提取
• 3.2.2 Kocuria sp.3-3基因组DNA的酶切
• 3.2.3 基因组文库构建
• 3.2.4 含木聚糖酶基因的阳性转化子的筛选
• 3.2.5 木聚糖酶基因DNA序列测定
• 3.2.6 木聚糖酶Kxp分析
• 本章小结
• 第四章 木聚糖酶Kxp在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及酶学性质研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 药品和试剂
• 4.1.3 实验菌株及质粒
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 木聚糖酶基因Kxg的克隆
• 4.1.6 木聚糖酶Kxp的表达
• 4.1.7 诱导产酶条件优化
• 4.1.8 重组木聚糖酶的纯化
• 4.1.9 重组木聚糖酶酶学性质研究
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 木聚糖酶基因克隆结果
• 4.2.2 木聚糖酶表达结果
• 4.2.3 诱导产酶条件优化
• 4.2.4 木聚糖酶的纯化
• 4.2.5 重组木聚糖酶酶学性质研究
• 本章小结
• 第五章 木聚糖酶Kxp定点突变初步研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验仪器
• 5.1.2 药品和试剂
• 5.1.3 实验菌株及质粒
• 5.1.4 实验用引物
• 5.1.5 培养基
• 5.1.6 定点突变PCR扩增模板的构建
• 5.1.7 引物设计
• 5.1.8 对木聚糖酶各位点进行定点突变
• 5.1.9 突变蛋白表达体系的构建
• 5.1.10 突变蛋白的诱导表达
• 5.1.11 突变木聚糖酶的纯化
• 5.1.12 突变木聚糖酶酶动力学常数测定
• 5.1.13 突变木聚糖酶KxpH102C热稳定性研究
• 5.2 结果和讨论
• 5.2.1 突变木聚糖酶基因的PCR扩增
• 5.2.2 突变蛋白的诱导表达
• 5.2.3 突变蛋白的纯化
• 5.2.4 突变木聚糖酶酶动力学常数测定
• 5.2.5 H102C热稳定性研究
• 5.2.6 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表