高压静电场离子束组合诱变木聚糖酶产生菌（黑曲霉菌）的技术研究

论文摘要

随着近代微生物技术的发展及其在诸多领域的应用，寻找能加速工程菌生产繁殖代谢速率的技术与方法，成为相关科技工作者集中关注的重要课题。低能离子束生物工程是立足于以低能离子作为新的诱变源这一物理学技术平台，采用低能离子注入技术，对生物体进行遗传改良的新兴交叉学科领域。它是通过将低能离子束注入生物体内，来研究其生物学效应和作用机理，并将其用于遗传育种和基因工程等方面的一种综合技术。高压静电场技术作为一项节能、经济、环保的新技术也越来越受到科研工作者的重视。本课题利用氮离子束和高压静电场这两个诱变因子的协同作用，在低能氮离子束诱变微生物技术的基础上，以木聚糖酶产生菌—黑曲霉A3菌为试验对象，研究高压静电场、氮离子束组合诱变技术，进行了旨在提高微生物代谢产量、活性，提高处理效果的复合诱变实验，得到酶活力较高的突变菌株ANE152823-3（358）并对其诱变机理进行了初步的分析。首先，通过低能氮离子束诱变来考察出发菌株的受诱变效应，研究了不同剂量的氮离子注入黑曲霉A3菌的诱变率和存活率，进而确定了最佳注入参数为能量10keV，注入剂量150×2.6×1013ions·（cm2·s）-1。在此注入剂量下，黑曲霉A3菌的正变率为20％，最终得到一株酶活比出发菌株高48.9％的菌株AN153-5（277）。其次，研究了高压静电场对黑曲霉A3孢子存活率及其生长量的影响。利用不同的电场剂量（场强×时间）处理黑曲霉A3孢子悬液，发现不同剂量对黑曲霉A3菌有不同的影响。其中，4.4×2(kV·cm-1)·min和3.6×2(kV·cm-1)·min的剂量对孢子的萌发有较明显的促进作用，与对照相比，孢子存活率提高了24％，其它剂量则抑制了孢子的萌发，存活率降低。当代酶活有明显提高的趋势，得到一株当代酶活提高33.3％的编号为AE2825（248）的菌。最后重点研究了高压静电场、氮离子束组合诱变黑曲霉产生的生物效应。选定电场存活率较高的4.4×2(kV·cm-1)·min和存活率较低而当代酶活较高的剂量5.6×2(kV·cm-1)·min去处理氮离子注入过的高产菌，在此组合诱变处理条件下，菌株的生长周期和菌落形态均发生了变化。经过多轮诱变和大量的筛选工作，获得了一株稳定的高产菌株，比出发菌株的酶活提高了92.5％，并获得复合诱变高产菌株ANE152823-3（358）。为探讨这一技术对试验对象产生诱变效应的机理，从抗氧化物酶、同功酶等方面进行了初步的探讨，结果表明各诱变因子得到的高产菌的三种“保护酶”和对照比均有明显提高；酯酶同功酶谱带增多、染色变深，泳道扫描波形有很大差异。本文创新点：①首次应用高压静电场和离子束注入组合诱变技术对木聚糖酶生产菌黑曲霉A3进行诱变育种，研究其生理和生化指标的变化，进而提高其代谢产量。②利用工业废弃物糖蜜代替葡萄糖作为发酵培养基附加碳源，使高产菌株以廉价原料生产高效、高稳定性、低成本的木聚糖酶，来促进木聚糖酶及其它饲用酶的商品化应用，以使得酶制剂在畜牧业中发挥出它所具有的巨大潜力和作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 纤维降解酶及其降解原理
• 1.2.1 纤维降解酶
• 1.2.2 纤维降解酶的降解原理
• 1.3 纤维降解酶在养殖业中的应用
• 1.3.1 纤维降解酶在奶牛饲养中的应用
• 1.3.2 纤维降解酶在家禽日粮中的应用
• 1.3.3 纤维降解酶在猪日粮中的应用
• 1.4 饲用纤维降解酶研究中的问题
• 1.5 木聚糖酶研究现状及应用
• 1.5.1 木聚糖酶的特性
• 1.5.3 木聚糖酶的应用
• 1.5.4 木聚糖酶的研究、生产及应用中存在的问题
• 1.6 离子束生物技术及在微生物诱变育种中的作用
• 1.6.1 离子束生物技术
• 1.6.2 离子束生物技术在微生物诱变育种的应用
• 1.7 高压静电场的生物学效应及发展状况
• 1.7.1 高压静电场的生物学效应
• 1.7.2 高压静电场生物效应研究发展现状
• 1.7.3 高压静电场技术的发展前景
• 1.8 本课题研究目的和思路
• 第二章 低能氮离子对黑曲霉（Aspergillus niger）A3菌的诱变试验
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 实验方法
• 2.1.6 黑曲霉 A3的氮离子注入诱变和筛选方法
• 2.2 结果及分析
• 2.2.1 木糖标准曲线的绘制
• 2.2.2 碳源浓度对黑曲霉 A3产木聚糖酶的影响
• 2.2.3 不同的附加碳源对产酶的影响
• 2.2.4 营养因子麸皮加入量与产木聚糖酶的关系
• 2.2.5 接种量对黑曲霉产木聚糖酶的影响
• 2.2.6 氮离子注入参数对黑曲霉 A3存活率的影响
• 2.2.7 低能氮离子注入黑曲霉 A3菌的诱变效果
• 2.2.8 传代稳定性实验
• 2.2.9 氮离子注入对黑曲霉 A3菌落形态的影响
• 2.2.10 经氮离子处理的黑曲霉 A3菌生长量的测定
• 2.3 讨论
• 第三章 高压静电场对黑曲霉 A3菌孢子存活率及生长的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验菌种
• 3.1.2 实验装置
• 3.1.3 培养基及培养条件
• 3.1.4 菌悬液的制备
• 3.1.5 高压静电场处理方法
• 3.1.6 黑曲霉 A3生长速度测定方法
• 3.1.7 电场强度和处理时间参数设置
• 3.1.8 数据分析方法
• 3.2 结果及分析
• 3.2.1 电场强度和处理时间对黑曲霉 A3存活率的作用效果
• 3.2.2 高压静电场处理黑曲霉 A3对其木聚糖酶产量的影响
• 3.2.3 高压静电场对黑曲霉 A3菌落形态的影响
• 3.2.4 测菌体生长量的方法
• 3.3 讨论
• +注入对黑曲霉菌组合诱变试验'>第四章 高压静电场、N⁺注入对黑曲霉菌组合诱变试验
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 出发菌株
• 4.1.2 剂量确定
• 4.1.3 工艺流程
• 4.1.4 高产菌株的筛选系谱
• 4.1.5 高产菌株的遗传稳定性
• 4.2 结论与分析
• 4.2.1 不同的电场剂量对氮离子处理的黑曲霉存活率及诱变率的影响
• 4.2.2 组合诱变处理后菌落形态的变化
• 4.2.3 高产菌株的生长曲线
• 4.3 讨论
• 第五章 复合诱变的高产菌株培养工艺的优化
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果及分析
• 5.2.1 初始碳源、氮源对木聚糖酶产量的影响
• 5.2.2 高产菌株发酵条件的优化
• 5.3 结论
• 第六章 高压静电场氮离子注入对黑曲霉的SOD、CAT、POD活性的影响
• 6.1 仪器和试剂
• 6.1.1 仪器
• 6.1.2 主要试剂
• 6.2 粗酶液制备
• 6.2.1 菌体培养
• 6.2.2 菌体收集
• 6.2.3 酶液的制备
• 6.3 三种保护酶酶活的测定
• 6.3.1 POD酶活的测定方法
• 6.3.2 CAT酶活的测定方法
• 6.3.3 SOD酶活的测定方法
• 6.4 结果及讨论
• 6.4.1 测试结果
• 6.5 讨论
• 第七章 高压静电场、低能氮离子注入对黑曲霉 A3的酯酶同功酶的影响
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 实验方法
• 7.2 结果及分析
• 7.2.1 供试菌株醋酶同工酶谱及分析
• 7.3 讨论
• 第八章 高压静电场离子束组合诱变技术的机理分析
• 8.1 生物因子引起自由基的生成
• 8.1.1 离子注入引起自由基的生成
• 8.1.2 静电辐照引起自由基的产生
• 8.2 抗氧化酶系对生物的保护作用
• 8.3 同功酶分析
• 结论和展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的学术论文