论文摘要
研究背景及目的原发性肝癌主要以肝细胞肝癌（HCC）为主，是我国常见的恶性肿瘤。早期治疗主要以手术切除为主。非手术疗法包括全身化学药物治疗、分子靶向治疗和局部物理化学治疗等。热疗是近年出现的一种较新的肿瘤治疗方法，目前已经取得了较为确切的临床疗效。它可以诱导肿瘤细胞的凋亡，阻滞肿瘤细胞的有丝分裂周期，增强肿瘤细胞的免疫原性，正向调节机体免疫功能。但是由于其作用机制研究尚欠充分，影响了肿瘤热疗在临床实践的深入应用。人NDRG2基因即N-Myc下游调节基因（N-myc down-stream regulatedgene2），属于NDRG家族。前期关于该基因的研究证实，NDRG2可以在很多正常组织中存在，参与细胞的生长、分化、凋亡和应激反应等多种生理过程。在结肠癌、神经胶质细胞瘤等一些肿瘤组织中，NDRG2表达降低，但是在某些肿瘤细胞的应激反应过程中，发现NDRG2基因表达上调。有学者推测其可能作为一种抑癌基因参与肿瘤的发生发展。本研究通过观察单次和多次热作用对肝癌细胞株MHCC97细胞增殖、凋亡、周期以及NDRG2和HSP70蛋白表达的变化，初步探讨热疗可能的分子作用机制。研究方法和内容将MHCC97细胞随机分为1个对照组和4个实验组，实验组以43℃恒温进行单次加热，4个实验组分别加热0.5h、1h、1.5h、2h，对照组不加热。5组细胞分别于培养时间3h、6h、9h、12h、24h后，观察MHCC97细胞的形态改变，MTT法观察各组细胞的增殖抑制情况，流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况，得出MHCC97细胞的最佳热疗时间。根据此结果，进行多次热作用，观察细胞生长的改变。Western-blot法分别检测单次和多次热作用后细胞NDRG2和HSP70蛋白的表达。实验数据采用SPSS12.0统计软件进行分析处理，进行析因设计方差分析，两两比较使用t检验，与对照组比较，P<0.05认为有统计学意义。实验结果1.热作用对细胞形态的影响对照组细胞贴壁生长良好，多角形，细胞边界清晰、透明，细胞连接成片，数量较多。经过不同时间的43℃热处理后，各实验组MHCC97细胞的形态均发生不同程度改变，出现体积缩小、细胞皱缩，变梭形，部分细胞脱落等。以加热2h后培养24h时细胞形态改变最明显。2.热作用对细胞增殖的影响43℃加热后，各实验组MHCC97细胞均受到不同程度的增殖抑制，以加热1h且培养24h后最为明显（抑制率为67.1%）。与单次加热比较，多次加热后细胞增殖抑制率有明显升高（抑制率89%）。3.热作用对细胞凋亡的影响应用流式细胞术检测肝癌细胞MHCC97热作用后的凋亡情况，结果显示：单次加热可以使细胞凋亡率升高，并且随着热处理时间的延长，细胞凋亡率也随之升高；实验组的细胞凋亡率随着加热后培养时间的延长而升高，于加热后培养时间为12h时达到高峰（各组凋亡率分别为2.7%、8.9%、23.3%、39.8%、57.5%），随后开始出现降低趋势；MHCC97细胞凋亡率在加热2h后培养12h时达到最大值（凋亡率为57.5%）；与单次热作用相比，经多次热作用后，细胞凋亡率有所升高，以间隔48h再次加热后培养24h时最高（凋亡率27.4%）。4.热作用对细胞NDRG2蛋白表达的影响单次热作用（43℃）能够降低MHCC97细胞中NDRG2蛋白的表达，加热后各组的NDRG2蛋白表达量低于对照组。在不同加热时间的各实验组中，以加热1h后的NDRG2蛋白表达量下降的最明显；在相同加热时间的各实验组中，4个实验组各自进行比较，随着加热后培养时间的延长，早期NDRG2蛋白表达略有下降，12-24h时降低最显著。经多次热作用后，MHCC97细胞中NDRG2蛋白表达量有所降低，但是各实验组之间未见明显差异。5.热作用对细胞HSP70蛋白表达的影响单次热作用后（43℃），MHCC97细胞中HSP70蛋白的表达逐渐升高，以加热2h后24h升高最显著。多次热作用后，HSP70蛋白表达亦升高，以间隔48h再次加热后升高最为显著。结论1.单次热作用（43℃）对人肝癌细胞株MHCC97具有杀伤和抑制增殖作用，并能够诱导其凋亡，发生G1期阻滞，同时降低NDRG2蛋白的表达，且使HSP70蛋白升高。2.多次热作用能够对MHCC97细胞产生更强的杀伤作用。NDRG2在多次热作用后无明显变化趋势。HSP70蛋白的表达在热作用后升高，以间隔48h再次加热组升高最明显。3. NDRG2可能具有细胞保护作用，并且可能间接参与细胞热应激反应。4.多次热作用使HSP70变化峰值推迟。
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