真核基因的原核表达及分析

论文摘要

利用原核细胞表达真核生物的蛋白质,是分子生物学研究的一个重要领域,也是获取大量纯化蛋白质、用于深入研究其性质及功能的有效途径之一。大肠杆菌表达系统完善,已被广泛用于外源基因的过量表达。本研究以大肠杆菌为表达体系,将12个来源不同的基因或融合基因,分别构建到不同细菌表达载体,转入细菌后,经IPTG诱导过量表达这些蛋白质,通过亲和层析纯化后用于分析鉴定。主要结果如下：1.通过PCR扩增目的基因几丁质酶（Chi）、禾谷镰刀菌特异单链抗体E1和E9三个基因,以及几丁质酶和抗菌肽（MsrAl）分别与这两个抗体形成的Chie1、Chie9、MsrA1e1和MsrA1e9四个融合基因；霍乱毒素B亚基（CTB）分别与热休克多肽p277形成的单体、二聚体和三聚体共三个融合蛋白（CTB-p277、CTB-2p277和CTB-3p277）；受赤霉菌毒素诱导的小麦基因AN和UN；将这12个基因的DNA酶切后,分别克隆到原核表达载体pET-22b,其中AN和UN基因构建到pGEX-6p-1载体。2.将上述载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导外源蛋白表达,优化表达条件。结果表明,培养细菌至浓度为OD600=0.6时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,不同蛋白的最佳诱导表达温度和时间如下：几丁质酶、抗体E1和E9、CTB-p277、CTB-2p277、CTB-3p277、AN和UN在28℃诱导6h的效果最好；而Chie1和Chie9融合蛋白37℃诱导6 h的表达量最高,MsrA1e1和MsrA1e9融合蛋白仅需在37℃诱导表达2 h。3.原核表达的12个外源蛋白经SDS-PAGE电泳和Western Blot分析,其分子量大小与预期完全一致。尽管这些蛋白在细菌中诱导表达的产物主要为包涵体,但利用8mol/L尿素缓冲液溶解蛋白包涵体,再经亲和层析柱纯化后,获得了大量可溶性蛋白；对部分蛋白的功能分析表明,它们具有抑制赤霉病菌的活性。这些研究结果为进一步研究这些蛋白的特性和功能打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 基础研究
• 1.1.1 赤霉菌与赤霉病
• 1.1.2 赤霉病的症状及危害
• 1.1.3 镰刀菌毒素
• 1.1.4 赤霉病的防治
• 1.2 抗菌肽和几丁质酶的研究进展
• 1.2.1 抗菌肽的理化性质及分类
• 1.2.2 抗菌肽的作用机理
• 1.2.3 抗菌肽的生物学活性及应用前景
• 1.2.4 抗菌肽的基因工程
• 1.3 原核表达综述
• 1.3.1 影响大肠杆菌表达系统表达量的因素
• 1.3.2 影响大肠杆菌表达体系中表达产物活性的因素
• 1.3.3 本研究中表达的外源蛋白
• 1.4 课题研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 培养基及缓冲液配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒DNA提取
• 2.2.2 PCR扩增目的基因
• 2.2.3 DNA片段回收
• 2.2.4 DNA片段的酶切和连接
• 2.2.5 感受态细胞制备
• 2.2.6 转化方法
• 2.2.7 外源基因的基本性质
• 2.2.8 融合蛋白诱导表达及纯化
• 2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.10 Western blot
• 2.2.11 检测表达后的菌体总蛋白
• 3 结果与分析
• 3.1 Chie1、Chie9、MsrA1e1、MsrA1e9、Chitinase、E1、E97个基因的原核表达,纯化及功能鉴定
• 3.1.1 Chie1、Chie9、MsrA1e1、MsrA1e9、Chitinase基因的克隆
• 3.1.2 Chie1、Chie9、MsrA1e1、MsrA1e9、Chitinase、E1、E9、CTB-p277、CTB-2p277、CTB-3p277、AN、UN基因的表达纯化
• 3.1.3 抗菌肽融合蛋白的抑菌实验
• 3.2 CTB-p277,CTB-2p277,CTB-3p22基因的表达纯化及活性分析
• 3.3 AN和UN基因密码子的修改及其表达与纯化
• 3.3.1 AN,UN基因密码子的修改
• 3.3.2 AN,UN基因的表达与纯化
• 3.4 表达并纯化外源蛋白信息汇总
• 讨论
• 参考文献
• 致谢