蛹虫草中虫草素等活性成分提取分离及生物活性研究

论文摘要

蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link.）在我国传统药学上是一种重要的药材,同时也是名贵中药冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的常用替代品。虫草素（Cordycepin）和虫草多糖（Cordycepic ploysaccharide）是蛹虫草的两种主要的生物活性物质。虫草素具有抗肿瘤、抗菌等多种生物活性,虫草多糖具有提高免疫力、抗氧化等生物活性。尽管现有较多的虫草素和虫草多糖的提取纯化方法,但提取纯化效率较低,为此建立起闪式提取等虫草素和虫草多糖的高效提取和分离纯化方法对促进虫草素的大规模工业化生产非常重要。虫草素的色谱特征是快速鉴定虫草素的可靠方法,为此本论文对虫草素的紫外、红外和核磁图谱进行了系统研究。尽管已有不少文献表明虫草素具抑瘤作用,但是否诱导胃癌细胞凋亡尚无人阐明,为此本论文鉴定了虫草素对胃癌细胞BGC-823的抑制作用及诱导凋亡的作用。以蛹虫草子实体为原料,首先通过四因素三水平的正交试验建立起通过回流提取与闪式提取虫草素和虫草多糖的最优化提取工艺,然后对两种提取方法在其最优提取工艺下进行了系统对比。研究发现回流提取法提取虫草素的最优提取工艺为的最佳条件是:乙醇浓度为25%,提取时间为2.5h,提取次数为2次,料液比为1:30。闪式提取法提取虫草素的最优提取条件是:蒸馏水,提取时间为3min,料液比=1:35,pH=3。在双方最优提取条件下闪式提取法表现出提取时间短（1:30）、提取得率高（0.263%:0.150%）,节省能源和试剂等优点。由于被浸提的活性物质其生物活性保持不变,同时提高了破碎速度,不仅适用于虫草素的提取,尤其适用于热敏性高、在较高温度易被酶水解破坏的有效成分的提取。通过醇沉、萃取和硅胶柱层析等方法建立起虫草素的分离纯化工艺条件,分离得到虫草素单体,纯度高达98.8%。另外通过醇沉和萃取等方法建立起粗多糖的分离纯化工艺。为建立准确鉴定虫草素的方法对虫草素的紫外光谱、红外光谱、核磁共振氢谱特征进行了表征。分别建立起虫草素的紫外光谱、红外光谱、核磁共振氢谱特征。最后对所提虫草素进行体外抗肿瘤活性和诱导胃癌细胞凋亡作用进行了初步研究。通过MTT实验证明虫草素对人胃癌BGC-823细胞有很好的抑制作用。通过hoechst染色、DNAladder等手段证明虫草素具有诱导BGC-823细胞凋亡的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 蛹虫草
• 0.1.1 蛹虫草的生物学特征
• 0.1.2 蛹虫草的培养方式
• 0.1.3 蛹虫草的化学成分及主要活性物质
• 0.1.4 蛹虫草的药理作用
• 0.2 虫草素
• 0.2.1 虫草素研究概况
• 0.2.2 虫草素的理化性质
• 0.2.3 虫草素的药理作用
• 0.2.4 虫草素的提取方法
• 0.2.5 虫草素的富集纯化方法
• 0.2.6 虫草素的检测方法
• 0.3 实验研究目的
• 第1章 蛹虫草活性成分虫草素和虫草多糖的综合提取
• 1.1 实验材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.1.4 回流法提取蛹虫草子实体中虫草素和虫草多糖的试验方法
• 1.1.5 虫草素含量的液相色谱（HPLC）检测方法
• 1.1.6 虫草多糖的含量测定
• 1.1.7 回流提取法提取虫草素和虫草多糖的单因素和四因素三水平正交试验处理方法
• 1.1.8 闪式提取法提取蛹虫草子实体中虫草素的研究
• 1.2 实验结果
• 1.2.1 虫草素的液相色谱分析图谱
• 1.2.2 回流提取法提取虫草素和虫草多糖的单因素处理结果
• 1.2.3 回流提取蛹虫草活性物质四因素三水平正交试验结果
• 1.2.4 闪式提取虫草素四因素三水平正交试验结果
• 1.2.5 闪式提取法和回流提取法提取效果的比较
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2章 虫草素纯化方法、结构确证的研究
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 虫草素自制样品的紫外全波长扫描
• 2.2.2 虫草素自制样品红外图谱
• 2.2.3 虫草素自制样品核磁图谱
• 2.2.4 自制样品高效液相图谱
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 虫草素抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡作用研究
• 3.1 实验材料和方法
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验细胞株
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 MTT 实验结果
• 3.2.2 虫草素处理胃癌细胞的生长状态
• 3.2.3 细胞核的hoechst33342、PI 染色结果
• 3.2.4 DNA ladder 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第4章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况