甘蔗内源低拷贝基因的筛选鉴定与PCR检测技术研究

论文摘要

利用已有转基因植物内参基因、已知低拷贝基因和基因功能检测筛选等方法,通过对有代表性甘蔗栽培品种的筛选与鉴定,获得了甘蔗特有的内源低拷贝基因,并以此为依据建立转基因甘蔗PCR检测技术体系,为转基因甘蔗检测标准的制定奠定基础：1、以具有一定代表性的12个甘蔗受试栽培品种为测试对象,在品种PCR检测结果的基础上,根据内参基因的特异性和通用性原则,筛选出在甘蔗里普遍存在的基因15个,分别是ALS、P4H、ENOL、GR、PS、TST、APRT、CYC、 PRR、F2KP、IPI、IVR、NCED、18S rRNA、5SrRNA-ITS。2、在内参基因特异性和通用性鉴定基础上,根据已知甘蔗分子量,采用定量PCR的方法筛选出假定单拷贝基因4个,分别是ALS、P4H、GR、 PRR。3、为验证定量PCR检测结果的真实性,对入选单拷贝基因之一的ALS基因进行了Southern blotting鉴定,结果显示只有单个杂交条带,证明入选基因为单拷贝基因。4、根据内参基因ALS的序列,设计了ALS基因的特异性引物,建立了ALS基因的定性检测体系。在12个甘蔗品种上进行扩增,均扩增出的目的片段,大小为171 bp。5、建立了ALS基因的定量检测体系,能够检测到0.16 ng的甘蔗基因组DNA。建立的定量PCR标准曲线相关系数（R2）为0.999,引物的扩增效率（E）为0.950553。6、利用建立的甘蔗内参基因ALS检测技术,对甘蔗和大宗转基因作物玉米、水稻、大豆进行了物种特异性鉴定,结果证明所建立的技术可对甘蔗进行物种特异性鉴定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 转基因植物研究进展及转基因产品安全性问题
• 1.2 世界各国对转基因产品含量的规定
• 1.3 植物转基因方法与外源目的基因拷贝数的关系
• 1.3.1 农杆菌介导法
• 1.3.2 基因枪法
• 1.3.3 电激穿孔法
• 1.3.4 脂质体法
• 1.3.5 花粉管通道法
• 1.3.6 化学物质诱导法
• 1.3.7 微注射法
• 1.4 转基因植物检测技术与检测阈值
• 1.4.1 DNA水平上的检测方法
• 1.4.1.1 定性PCR检测
• 1.4.1.2 定量PCR检测
• 1.4.1.3 Southern Blotting
• 1.4.1.4 基因芯片
• 1.4.2 蛋白质水平上的检测方法
• 1.4.2.1 酶联免疫吸附法
• 1.4.2.2 免疫试纸条法
• 1.4.2.3 Western Blotting
• 1.4.3 植物转基因检测新技术
• 1.5 影响转基因植物PCR检测技术准确性的因素
• 1.5.1 DNA质量
• 1.5.2 转基因植物外源目的基因拷贝数
• 1.5.3 PCR反应程序
• 1.5.4 退火温度
• 1.5.5 Taq酶质量
• 1.5.6 转基因阳性对照的作用及局限性
• 1.6 甘蔗染色体的复杂性及转基因检测存在的问题
• 1.7 外源基因拷贝数检测方法
• 1.8 研究内源低拷贝基因的意义
• 1.8.1 转基因植物PCR检测内参基因研究进展
• 1.8.2 内源低拷贝基因的特征和PCR检测技术要求
• 1.8.3 内源低拷贝基因的应用
• 1.8.3.1 物种特异性鉴定
• 1.8.3.2 DNA提取和纯化的质量
• 1.8.3.3 判断PCR检测结果的精确性
• 1.8.3.4 建立定量检测标准曲线
• 1.9 本研究的目的和技术路线
• 1.9.1 本研究的目的和意义
• 1.9.2 本研究的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂和耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 甘蔗材料的遗传背景和代表性分析
• 2.2.2 总DNA提取与质量测定
• 2.2.3 已有转基因植物内参基因同源检测筛选
• 2.2.3.1 引物设计
• 2.2.3.2 PCR反应体系和程序
• 2.2.3.3 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
• 2.2.3.4 目的片段回收
• 2.2.3.5 目的片段的克隆和测序
• 2.2.4 已知低拷贝基因同源检测筛选
• 2.2.4.1 引物设计
• 2.2.4.2 PCR反应体系和程序
• 2.2.4.3 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
• 2.2.4.4 目的片段回收
• 2.2.4.5 目的片段的克隆和测序
• 2.2.5 根据基因功能检测筛选
• 2.2.5.1 引物设计
• 2.2.5.2 PCR反应体系和程序
• 2.2.5.3 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
• 2.2.5.4 目的片段回收
• 2.2.5.5 目的片段的克隆和测序
• 2.2.6 入选基因片段实时荧光定量PCR拷贝数分析
• 2.2.7 低拷贝基因Southern Blotting鉴定
• 2.2.7.1 探针制备
• 2.2.7.2 探针标记效果测定
• 2.2.7.3 基因组DNA的制备
• 2.2.7.4 DNA（gDNA）酶切产物回收纯化
• 2.2.7.5 凝胶处理
• 2.2.7.6 制桥与转膜
• 2.2.7.7 膜固定与预杂交
• 2.2.7.8 洗膜
• 2.2.7.9 免疫测定
• 2.2.8 甘蔗内源低拷贝基因的定性与定量检测体系
• 2.2.9 入选低拷贝基因实证应用
• 3 结果与分析
• 3.1 甘蔗材料的遗传背景和代表性分析
• 3.2 DNA质量检测
• 3.3 已有转基因植物内参基因同源检测筛选
• 3.3.1 引物序列与PCR反应参数
• 3.3.2 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
• 3.3.3 目的片段回收测序
• 3.4 已知低拷贝基因同源检测筛选
• 3.4.1 引物序列与PCR反应参数
• 3.4.2 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
• 3.4.3 目的片段回收测序
• 3.5 根据基因功能检测筛选
• 3.5.1 引物序列与PCR反应参数
• 3.5.2 PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性分析
• 3.5.3 目的片段回收测序
• 3.6 候选基因特异片段的筛选
• 3.7 实时荧光定量PCR
• 3.7.1 实时荧光定量PCR反应体系和反应程序
• 3.7.2 实时荧光定量PCR引物扩增效率
• 3.7.3 实时荧光定量PCR溶解曲线分析
• 3.7.4 甘蔗内源基因拷贝数
• 3.8 Southern Blotting分析
• 3.8.1 ALS基因的探针制备
• 3.8.2 探针标记灵敏度
• 3.8.3 甘蔗基因组DNA酶切效果与Southern Blotting结果
• 3.9 甘蔗内源低拷贝基因的定性与定量检测体系
• 3.9.1 甘蔗内源低拷贝基因定性检测体系
• 3.9.2 甘蔗内源低拷贝基因定量检测体系
• 3.10 甘蔗内源低拷贝基因PCR检测体系的应用
• 4 讨论
• 4.1 实验材料的选择
• 4.2 定性PCR与实时荧光定量PCR的退火温度不同的分析
• 4.3 ALS基因在甘蔗和玉米上的分析
• 4.4 实时荧光定量PCR拷贝数计算公式分析
• 4.5 ALS基因的Southern blotting分析
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ 缩写词（Abbreviation）
• 附录Ⅱ CTAB法
• 附录Ⅲ Southern Blotting试剂
• 致谢