Netrin-1基因对胎盘血管生成作用的体内、外研究

论文摘要

第一部分RNA干扰体外沉默HUVECs的Netrin-1基因表达目的通过体外RNA干扰技术稳定沉默Netrin-1基因在HUVECs mRNA和蛋白水平的表达,为后续的细胞实验提供基础。方法1.分离、培养原代HUVECs,利用细胞形态学和免疫荧光实验鉴定细胞表面Ⅷ因子和CD31的表达以验证其内皮细胞特性；2.利用RNA干扰技术将表达Netrin-1 shRNA的真核表达载体瞬时转染入HUVECs,并利用G418稳定筛选；3.利用实时荧光定量PCR检测HUVECs在RNA干扰前后Netrin-1基因的mRNA水平表达；4.利用免疫印迹法检测HUVECs在RNA干扰前后Netrin-1基因的蛋白水平表达。结果1.分离所得的原代HUVECs,细胞形态学具有内皮细胞特性,免疫荧光鉴定Ⅷ因子和CD31的表达强阳性；2.RNA干扰技术体外稳定转染后可得到GFP稳定高表达的HUVECs;3. HUVECs稳定转染shNetrin-1后,实时荧光定量PCR检测发现其Netrin-1基因的mRNA水平表达下降了（86.54±3.10）%；4. HUVECs稳定转染shNetrin-1后,免疫印迹法检测发现其Netrin-1基因的蛋白水平表达下降了（77.62±6.92）%。结论利用体外RNA干扰技术可稳定高效沉默Netrin-1基因在HUVECs mRNA和蛋白水平的表达,为进一步的细胞生物功能学研究奠定了实验基础。第二部分Netrin-1基因对HUVECs与血管形成相关能力的作用目的研究上调和下调Netrin-1的表达对HUVECs细胞活力、增殖、迁移和管腔形成能力的影响,了解Netrin-1基因在HUVECs形成血管过程中的作用。方法1.将HUVECs分为对照组（细胞转染空白质粒shVetor,在普通培养基中培养）,Netrin-1组（细胞转染空白质粒shVetor,在含100ng/ml Netrin-1的条件培养基中培养）,shNetrin-1组（细胞转染目的质粒shNetrin-1,在普通培养基中培养）3组；2.利用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT）比色法分别检测3组HUVECs12、24、48小时的细胞活力；3.利用克隆形成法检测3组HUVECs的增殖能力；4.利用transwell模型迁移实验检测3组HUVECs的迁移能力；5.利用小管形成实验检测3组HUVECs的管腔形成能力。结果1.给予Netrin-1刺激24小时后,HUVECs细胞活力明显提高；沉默Netrin-1的表达24小时后,HUVECs细胞活力明显下降；2. Netrin-1干预的HUVECs克隆形成率由shVector组的（60±6.67）%提高至（92.22±5.09）%；沉默Netrin-1表达的HUVECs克隆形成率则降至（30±3.33）%（p<0.05）;3.与shVector组（81.8±7.95）相比,Netrin-1组HUVECs的细胞迁移数目可达（124.2±15.9）;shNetrin-1组HUVECs的细胞迁移数目降至（40.4±8.56）（p<0.05）；4.与shVector组（32.6±3.13）相比,Netrin-1可增加HUVECs管腔形成分支点数目（57.4±6.88）；沉默Netrin-1则使其减少（19.6±4.45）（p<0.05）。结论外源性给予Netrin-1可以促进HUVECs的细胞活力、增殖、迁移和管腔形成能力；沉默Netrin-1表达则可以抑制HUVECs以上与血管形成相关的各项生物学功能。Netrin-1是重要的促HUVECs细胞活力、增殖、迁移和管腔形成能力的基因。第三部分RNA干扰体内沉默孕鼠胎盘的Netrin-1基因表达目的通过体内RNA干扰技术沉默Netrin-1基因在孕鼠胎盘mRNA和蛋白水平的表达,为后续动物水平的研究提供实验基础。方法1.利用体内RNA干扰技术将表达Netrin-1 shRNA的真核表达载体转染入孕鼠胎盘组织；2.转染后的孕鼠组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP表达以了解质粒的转染效果；3.利用实时荧光定量PCR检测RNA干扰前后的孕鼠胎盘组织Netrin-1基因的mRNA水平表达；4.利用免疫印迹法和免疫组化实验定量和定位检测RNA干扰前后的孕鼠胎盘组织Netrin-1基因的蛋白水平表达。结果1.转染后胎盘组织的冰冻切片在荧光下观察可见GFP大面积高表达,体内转染效果理想；2.孕鼠胎盘体内转染shNetrin-1后,实时荧光定量PCR检测发现其Netrin-1基因的mRNA水平表达下降（63.49±9.58）%；3.孕鼠胎盘体内转染shNetrin-1后,免疫印迹法发现其Netrin-1基因的蛋白水平表达下降（57.93±11.76）%；免疫组织化学实验显示Netrin-1主要表达于胎盘血管内皮细胞。结论利用体内RNA干扰技术可有效沉默Netrin-1基因在孕鼠胎盘mRNA和蛋白水平的表达,为后续动物水平的在体研究奠定了实验基础。第四部分Netrin-1基因对胎盘血管生成和胎儿发育的作用目的研究上调和下调Netrin-1的表达对孕鼠胎盘血管生成和胎鼠发育的影响,了解Netrin-1基因在胎盘血管形成过程中的作用。方法1.将56只孕鼠随机分成4组,孕14天时行相应的胎盘定位注射：对照组（20ul生理盐水）,Netrin-1组（20ul含400ng重组Netrin-1因子的生理盐水）,shVector组（20ul含10ug shVector的转染复合物）,shNetrin-1组（20ul含10ug shNetrin-1的转染复合物）;2.测量孕17天大鼠干预注射后胎盘及胎鼠的重量；3.利用CD34因子免疫组化实验检测孕17天大鼠干预注射后的胎盘血管密度。结果1.与对照组（1.57±0.1）g相比,Netrin-1组孕鼠的胎盘重量（1.83±0.12）g明显增加；与shVector组（1.53±0.11）g相比,shNetrin-1组孕鼠的胎盘重量（1.35±0.09）g明显下降（p<0.05）；2.CD34的免疫组化实验结果显示,Netrin-1组孕鼠胎盘的微血管数量（98.4±9.07）较对照组（80.2±5.89）显著增多；shNetrin-1组孕鼠胎盘的微血管密度（54.0±5.34）较shVector组（75.6±7.3）显著减少（p<0.05）；3.与对照组（2.46±0.18）g相比,Netrin-1组的胎鼠重量（2.67±0.10）g增加；与shVector组（2.40±0.14）g相比,shNetrin-1组的胎鼠重量（2.10±0.20）g下降（p<0.05）。结论外源性给予Netrin-1可以促进孕鼠胎盘的血管形成能力和胎鼠的生长发育；沉默Netrin-1表达则可以使孕鼠胎盘的血管形成能力和胎鼠的生长发育受到抑制。Netrin-1基因是促胎盘血管生长发育的重要基因。

论文目录

• 前言
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 技术路线
• 第一部分 RNA干扰体外沉默HUVECs的Netrin-1基因表达
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 Netrin-1基因对HUVECs与血管形成相关能力的作用
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 RNA干扰体内沉默孕鼠胎盘的Netrin-1基因表达
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 Netrin-1基因对胎盘血管生成和胎儿发育的作用
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录一 中英文缩略词表
• 附录二 博士期间发表论文
• 致谢