论文摘要
随着全民食盐加碘政策的实施，碘缺乏病已得到了有效控制。但另一方面，我国生活在水源性高碘地区的人口已达到6000万。此外，由于摄入含碘高的药物例如胺碘酮，或由于补碘不当和食物碘过多造成的过量碘对机体的危害日益受到关注。因此，研究过量碘对人体的危害以采取有效的干预措施成为急需解决的重要问题。以往的研究证实，过量碘摄入导致的最常见公共卫生问题为高碘性甲状腺肿。目前有许多学说解释其损伤机制，例如：碘阻断效应，贮碘保护学说，脱碘酶障碍学说，甲状腺细胞自主结节说等，每一种学说都可以解释过量碘导致甲状腺激素代谢的部分变化，但是，没有一种学说可以从根本上解释它。因此，对其机制进行进一步的基础研究是很有必要的。另一微量元素硒以硒半胱氨酸的形式存在于许多蛋白质以及酶的活性中心，是谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）和脱碘酶（deiodinase，D）的重要组成成分，在甲状腺激素代谢过程中具有重要作用。以往对硒、碘关系的研究主要集中在两者都缺乏的状态，有关不同剂量硒干预过量碘危害的研究国内外均未见报导。本研究在观察过量碘所致甲状腺损伤的基础上，从氧化／抗氧化平衡、脱碘酶、甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）、组织蛋白酶（cathepsin）以及甲状腺细胞凋亡等的变化入手，应用荧光定量PCR、Western blot和流式细胞术等方法观察了过量碘对甲状腺激素代谢过程中关键点的影响，同时通过补充不同剂量硒来观察硒对过量碘导致的甲状腺损伤的干预作用。现将结果报告如下：第一部分过量碘对小鼠甲状腺的影响及硒的干预作用研究目的建立过量碘和硒干预的小鼠动物模型，系统完整地观察过量碘和不同剂量硒对甲状腺的影响。全面深入地探讨过量碘导致甲状腺激素代谢紊乱以及硒干预的机制，并为选择合适的硒干预剂量提供理论依据。方法将刚断乳的清洁级Balb／c小鼠320只（雌性）按体重随机分为8组，每组40只动物，分别给予自来水或含碘酸钾（potassium iodate，KIO3）和／或亚硒酸钠（sodium selenite，Na2SeO3）的自来水，正常组饮水内不加碘或硒，过量碘组碘剂量为3000μg／L碘，过量碘补硒组分为6组，饮水中除含3000μg／L碘，还分别含不同浓度的Na2SeO3（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.75mg／L硒）。四个月后，观察甲状腺病理变化，测定小鼠尿和甲状腺碘含量，尿和肝脏硒水平，血清甲状腺激素水平，血浆、肝、肾和甲状腺的氧化／抗氧化水平，肝、肾和甲状腺1型脱碘酶（type 1 deiodinase，D1）的活性和mRNA水平，甲状腺TPO活性和mRNA水平。结果各组小鼠体重、甲状腺重量、甲状腺重量／体重无显著性差异。每日摄入3000μg／L碘，会导致甲状腺组织和尿中碘水平显著升高（p＜0.05），肝脏和尿中硒水平显著下降（p＜0.05）；甲状腺病理切片表现为胶质潴留性甲状腺肿，甲状腺滤泡明显增大，滤泡腔内充满红色胶质，上皮细胞呈扁平状；甲状腺电镜表现为细胞核扁平，线粒体肿胀、溶酶体罕见；血清四碘甲状腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）显著升高（p＜0.05），三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）显著降低（p＜0.05）；肝、肾和甲状腺GSH-Px和SOD活性显著下降（p＜0.05），MDA显著升高（p＜0.05）；肝、肾和甲状腺D1活性和mRNA水平显著下降（p＜0.05）；TPO活性和mRNA水平均显著下降（p＜0.05）。补充硒对过量碘造成的甲状腺损伤有干预作用：①补硒组尿碘水平较过量碘组显著升高（p＜0.05），0.2mg／L补硒组甲状腺内碘含量较过量碘组显著下降（p＜0.05）；②补硒组甲状腺滤泡腔胶质潴留，细胞器病变减轻，溶酶体、线粒体等细胞器病变较过量碘组好转；③0.1～0.5mg／L补硒组尿硒、肝硒以及甲状腺激素水平与正常组比较差异无显著性；④0.2～0.3mg／L补硒组肝、肾和甲状腺GSH-Px、SOD活性和MDA水平与正常组比较无显著性差异；⑤各补硒组肝、肾和甲状腺D1 mRNA水平与正常组比较无显著性差异，但是只有0.1～0.4mg／L补硒组D1活性与正常组无显著性差异；⑥0.1～0.75mg／L补硒组甲状腺TPO mRNA水平与正常组比较差异无显著性，但是只有0.1～0.3mg／L补硒组TPO活性与正常组比较差异无显著性。结论通过动物研究发现：①过量碘对甲状腺激素代谢过程的影响主要表现为：氧化／抗氧化水平失衡，脱碘酶和TPO的活性和mRNA水平下降。②过量碘通过降低机体GSH-Px，TPO和D1的活性，导致甲状腺激素合成和分解受到影响，导致激素水平失衡和甲状腺肿大。③补充硒对过量碘导致的硒营养水平低下，氧化／抗氧化水平失衡，脱碘酶、TPO活性和mRNA水平下降都有有效的干预作用。合适的硒干预剂量范围是0.2～0.3mg／L（0.05mg／kg·bw～0.075mg／kg·bw）。第二部分过量碘对FRTL细胞的影响及硒的干预作用研究目的观察过量碘对FRTL细胞的组织蛋白酶活性和mRNA水平、氧化／抗氧化平衡、细胞凋亡以及细胞凋亡相关基因bcl-2和bax的mRNA和蛋白质水平变化，并观察不同剂量硒对过量碘引起这些指标变化的干预作用。从而进一步深入探讨过量碘性胶质潴留的发生机制。方法FRTL细胞培养于Kaighn’s改良的Ham’s F-12培养基，培养基内添加6种激素：1mU／ml牛促甲状腺激素，0.01mg／ml胰岛素，10nmol／L氢化可的松，0.005mg／ml转铁蛋白，10ng／ml生长抑素和10ng／ml甘氨酰-组氨酰赖氨酸。测定下列指标：①琼脂糖凝胶电泳法观察碘化钾（potassium iodide，KI）对FRTL细胞DNA的损伤以及硒的干预作用。细胞分为4组：正常对照组：培养基内不加碘或硒；过量碘组：培养基内加入KI，浓度为10mmol／L；单硒组：培养基内加入Na2SeO3，浓度为0.1μmol／L Na2SeO3；过量碘补硒组：培养基内含10mmol／L KI和0.1μmol／L Na2SeO3。收集细胞，提取DNA，琼脂糖凝胶电泳，观察DNA电泳条带。②流式细胞术测定细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量。细胞分组：正常对照组：培养基内不加碘或硒；过量碘组：培养基内加入KI，浓度为1，5，10，50和100mmol／L；单硒组：培养基内加入亚硒酸钠，硒浓度分别为0.1，0.5，1.0，2.0和5.0μmol／L；过量碘加硒组：培养基内加入10mmol／L KI和不同浓度硒，硒浓度分别为0.1，0.5，1.0，2.0和5.0μmol／L。收集细胞，流式细胞仪FL-1 530nm测定。③流式细胞仪测定细胞凋亡率。细胞分组：正常对照组：培养基内不加碘或硒；过量碘组：培养基内加入KI，浓度为1，5，10，50和100mmol／L；过量碘加硒组：培养基内加入10mmol／L KI和不同浓度Na2SeO3，硒浓度分别为0.1，0.5，1.0和5.0μmol／L。收集细胞，Annexin V-FITC／7-AAD染色法测定细胞凋亡率。④测定CB、CD、bcl-2和bax mRNA的水平。细胞分组：正常对照组：培养基内不加碘或硒；过量碘组：培养基内含10mmol／L KI（bcl-2和bax）或50mmol／L KI（CB和CD）；单硒组：培养基内加入Na2SeO3；浓度为0.1μmol／L Na2SeO3；过量碘补硒组：培养基加入10mmol／L KI（bcl-2和bax）或50mmol／L KI（CB和CD）和0.1μmol／L Na2SeO3。收集细胞，荧光定量PCR测定CB、CD、bcl-2和bax mRNA的水平。⑤测定凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白水平。细胞分组：正常对照组：培养基内不加碘或硒；过量碘组：培养基内含10mmol／LKI；单硒组：培养基内加入0.1μmol／L Na2SeO3；过量碘补硒组：培养基内加入10mmol／L KI和0.1μmol／L Na2SeO3。收集细胞，Western blot测定bcl-2和bax蛋白水平。⑥CB、CD活性的测定。细胞分组：正常对照组：培养基内不加碘或硒；过量碘组：培养基内加入不同剂量KI，浓度分别为1、5、10、50和100mmol／L；单硒组：培养基内加入不同剂量Na2SeO3，硒浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μmol／L；过量碘加硒组：培养基内加入10mmol／L KI和不同浓度Na2SeO3，硒浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μmol／L。收集细胞，测定CB、CD活性。结果碘和硒对FRTL细胞的影响如下：①10mmol／L KI浓度可导致FRTL细胞DNA凝胶电泳出现典型的梯状条带，过量碘加硒组条带较过量碘组少，正常和单硒组均未见梯状条带。②5，10，50和100mmol／L过量碘组ROS升高（p＜0.05）。0.1～1.0μmol／L Na2SO3可有效干预由过量碘导致的ROS水平升高。③10、50、100mmol／L碘剂量组FRTL细胞凋亡率升高（p＜0.05）。补充0.1～0.2μmol／L Na2SO3可以干预由过量碘引起的细胞凋亡率增加，但是较正常组有升高趋势。④过量碘组bcl-2 mRNA和蛋白水平降低（p＜0.05），bax mRNA和蛋白水平升高（p＜0.05）。补充0.1μmol／L硒，bcl-2的mRNA和蛋白质水平均较过量碘组升高（p＜0.05），但是较正常组下降（p＜0.05）；bax的mRNA水平较正常组升高（p＜0.05），较过量碘组下降（p＜0.05），蛋白质水平bax较过量碘组下降（p＜0.05），但较正常组升高（p＜0.05）。⑤50mmol/L碘作用24h使CDmRNA水平显著下降（p＜0.05），CBmRNA水平有下降趋势，但是差异无显著性。补充硒可以升高其mRNA水平，硒碘共作用24小时CB、CD mRNA水平与正常组比较差异无显著性，但是较正常组有下降趋势。⑥50mmol/L碘作用12h开始出现CB活性的下降（p＜0.05），但是需作用24h始出现CD活性的下降（p＜0.05）。CB、CD活性与碘剂量呈显著性负相关（p＜0.05）。Na2SeO3浓度达到2.0μmol/L即会出现CB、CD活性的下降（p＜0.05）。CB、CD活性与硒剂量呈显著性负相关（p＜0.05）。0.1～0.5μmol/L补硒组CB、CD活性较过量碘组显著升高（p＜0.05）。结论通过细胞实验发现：①过量碘降低CB、CD活性和mRNA水平，影响胶质的分解，这是导致过量碘性甲状腺胶质潴留的机制之一。补充0.1～0.5μmol/L剂量范围的Na2SeO3可使CB、CD的损伤好转，这也是硒可缓解胶质潴留的原因之一。②过量碘通过影响细胞氧化/抗氧化水平以及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达，导致细胞凋亡增加。补充0.1～0.2μmol/L剂量范围的Na2SeO3可使过量碘引起的氧化损伤以及bcl-2和bax的损伤好转，这也是硒可干预甲状腺自身免疫性疾病的机制之一。
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相关论文文献
- [1].过量碘对甲状腺激素代谢的损伤及硒的干预作用[J]. 卫生研究 2009(04)