论文摘要
本研究以对潮霉素敏感的银耳野生菌株Tr 21-01作为供试菌株,以pBHg-BCA为出发质粒,进行如下研究：参考银耳的密码子使用偏好性分析结果,对人胰岛素基因BCA进行密码子优化并人工合成优化后基因BCA1；将来源于双胞蘑菇的gpd启动子替换为银耳内源高表达基因启动子p-G06；采用密码子优化和启动子替换两个策略,结合传统的载体构建方法和高效的In-Fusion法构建3个真核表达载体；利用高效的农杆菌介导法将载体转化到银耳Tr 21-01的孢子内；使用PCR, RT-PCR和ELISA逐级筛选最终获得可表达人胰岛素的银耳阳性转化子；使用实时荧光定量PCR相对定量法检测各银耳转化子基因组中BCA或BCA1基因相对于银耳Tr 26的BCA基因的含量。详细结果如下：1)对人胰岛素基因进行密码子优化和基因合成。参照银耳密码子使用偏好性分析的结果,在不改变表达产物氨基酸序列的基础上,共替换了BCA基因上的29个密码子,使优化后的BCA1基因符合银耳的偏好。在BCA1基因两端添加多克隆位点和保护碱基,即259bp的DNA片段MCS1-BCA1-MCS2,合成后连入pMD18-T载体中,得到pUC-BCA1（1）。2)真核表达载体的构建。使用传统的构建载体方法,结合先进的In-Fusion克隆技术,以pBHg-BCA为出发质粒,通过构建2个中间载体pUC-BCA1（2）和pBHg-BCA1（2）,最终成功构建了pBHg-BCA1-G06, pBHg-BCA-G06和pBHg-BCA1-gpd共3个表达载体并测序验证。3)运用农杆菌介导转化方法转化银耳。使用高效的农杆菌介导转化方法,通过农杆菌EHA105的介导,成功地将以上3个载体pBHg-BCA-G06, pBHg-BCA1-gpd和pBHg-BCA1-G06依次转化到银耳Tr21-01的孢子中,获得众多拟转化子,使用潮霉素和头孢霉素重复筛选后,从各类中随机挑取33个拟转化子保种并编号命名Tr301-333、Tr401-433和Tr 501-533,合计93个菌株。4)银耳阳性转化子的筛选及高表达菌株的鉴定。在DNA、RNA和蛋白质三个水平上,依次采用PCR、RT-PCR和ELISA对质粒pBHg-BCA-G06,pBHg-BCA1-gpd和pBHg-BCA1-G06的银耳拟转化子进行逐级检测,最终筛选到17、5和5个可表达人胰岛素的阳性银耳转化子。由ELISA检测结果可知,密码子优化和启动子替换单独使用可实现提高表达量最大值38.9%和50.2%,所获得高表达菌株的比例为40%和58%,说明单独使用密码子优化和启动子替换两种策略都有助于提高人胰岛素的表达量；相比之下,替换启动子比优化密码子对人胰岛素表达水平的影响更显著；而同时使用密码子优化和启动子替换这两种策略可得到提高表达量最大值为104.5%,高表达菌株所占比例为100%,说明两策略共同作用时比单独作用时效果更显著。5)使用实时荧光定量PCR相对定量法检测所有可表达人胰岛素的阳性银耳转化子基因组中外源基因BCA或BCA1和内参基因GPD的Ct值,并采用2-△△Ct算法计算各转化子基因组的BCA或BCA1基因相对Tr 26的BCA基因的含量。结果显示各转化子基因组中BCA或BCA1基因含量相差很大,BCA或BCA1基因含量与人胰岛素表达量无显著相关性,替换启动子对BCA或BCA1基因插入银耳转化子基因组具有极显著的抑制作用,密码子优化对BCA或BCA1基因插入银耳转化子基因组具有显著的促进作用。