奶牛乳腺炎病因学和金黄色葡萄球菌的分子调查及Fnbp蛋白免疫

论文摘要

乳腺炎是威胁奶牛业最为频繁和损失最为严重的疾病之一,世界每年因乳腺炎的损失超过350亿美元,乳腺炎主要包括临床型和隐性乳腺炎,临床型乳腺炎可引起弃奶、奶产量暂时性减少和奶牛的过早淘汰;隐性乳腺炎可引起乳腺慢性感染从而造成奶产量长期下降。尽管国内外对乳腺炎进行了大量研究,但仍存在众多不足:首先对引起乳腺炎的病原菌缺乏系统研究;针对近些年来引起乳腺炎的主要病原菌缺少快速简捷的检测方法;尤其对目前乳腺炎的主要病原菌金黄色葡萄球菌缺少分子流行病学资料;目前国内外还缺少预防金黄色葡萄球菌效果较好的疫苗;目前我国对隐性乳腺炎还缺乏重视;我国众多奶牛散养户在顽固性乳腺炎面前束手无策等等,为探讨、解决以上问题,进行了本项研究,主要结果如下:1.对不同类型类型乳腺炎的细菌学系统分析对山东7个地区14个奶牛场做了临床型和隐性乳腺炎调查,并且采取了临床乳腺炎病牛234个乳样,隐性乳腺炎241个乳样分别做了细菌学检查,结果表明:泌乳期临床型乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌、链球菌、酵母菌和棒状杆菌为主;干奶期临床型腺炎病原菌以大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和酵母菌为主;隐性乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,链球菌、酵母菌、假单胞菌和棒状杆菌为主;厌氧菌在隐性乳腺炎、泌乳期临床型乳腺炎和干奶期临床型乳腺炎乳样的检出率分别为5.82%,4.17%,10.16%;引起隐性乳腺炎和干奶期乳腺炎细菌的共感染率较高,与引起泌乳期乳腺炎病原菌的共感染率差异极显著(P<0.01),引起隐性乳腺炎与引起干奶期乳腺炎病原菌的共感染率差异不显著(P>0.05)。54个顽固性乳腺炎中酵母菌(25.92%)、大肠杆菌(12.96%)、凝固酶阴性葡萄球菌(14.81%)、链球菌(12.96%)和金黄色葡萄球菌(9.26%)占有较大的比例,但有12.96%的乳区分离不到细菌。2.检测乳腺炎主要致病菌:金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌的多重PCR方法的建立参照Genebank发表的序列,在金黄色葡萄球菌,无乳链球菌和停乳链球菌16S rRNA与23S rRNA之间的区域设计了3对引物,参照念珠菌和隐球菌的18 S rRNA的序列设计1对引物,建立了检测金黄色葡萄球菌,无乳链球菌和停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法,结果表明:本试验建立的多重PCR方法具

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1. 奶牛乳腺炎的研究概述
• 1.1 发生与危害
• 1.2 病原学
• 1.3 乳腺炎的发病规律
• 1.4 乳腺的自然防御机制
• 1.5 乳腺炎的诊断
• 1.6 乳腺炎引起的乳腺的组织化学及乳汁成分的变化
• 1.6.1 织化学变化
• 1.6.2 乳汁成分的变化
• 2. 奶牛乳腺炎防治的研究进展
• 2.1 预防措施
• 2.2 乳房炎治疗研究进展
• 3. 葡萄球菌肠毒素分子生物学与检测的研究进展
• 3.1 肠毒素的分子生物学研究进展
• 3.2 肠毒素的性质与作用
• 3.3 金葡菌肠毒素检测方法的研究进展
• 3.4 对乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和 FSST-1 检测的目的与意义
• 4. 金黄色葡萄球菌 ECMBPs 的研究进展
• 4.1 ECMBPs 的概念的提出
• 4.2 ECMBPs 的种类与结构
• 4.3 几种重要的表面蛋白研究进展
• 4.4 Fnbp 作为疫苗的研究进展
• 第二章 奶牛乳腺炎的病原菌的分离、鉴定和菌群分析
• 1 材料与方法
• 1.1 被检奶牛
• 1.2 材料
• 1.3 细菌分离与培养
• 1.4 统计方法
• 2. 结果
• 2.1 临床型乳腺炎细菌的分离结果
• 2.2 奶牛干奶期临床型乳腺炎的细菌分离情况
• 2.3 隐性乳腺炎细菌的分离结果
• 2.4 分离细菌需氧菌，厌氧菌和兼性厌氧菌的分类
• 2.5 不同类型乳腺炎病原菌的共感染现象
• 3. 小结和讨论
• 3.1 不同类型乳腺炎病原菌类群具有不同的特点
• 3.2 酵母菌作为一种新型乳腺炎病原菌
• 3.3 葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最重要的致病菌
• 3.4 链球菌仍然是乳腺炎的重要致病菌
• 3.5 临床型乳腺炎病牛未发病乳区具有明显的带菌现象
• 3.6 厌氧菌可以引起奶牛乳腺炎
• 3.7 环境性病原菌在引起隐性乳腺炎方面起重要作用
• 第三章 奶牛隐性乳腺炎诊断方法的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 乳样的来源
• 1.2 隐性乳腺炎的检测方法及采样方法
• 1.3 病原菌的分离与鉴定
• 1.4 体细胞计数方法
• 1.5 乳酸脱氢酶（LDH），β--N--乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase），碱性磷酸酶’（ALP），酸性磷酸酶（ACP）的测定
• 2. 结果
• 2.1 奶牛隐性乳腺炎的不同诊断方法比较
• 2.2 隐性乳腺炎乳样细菌的分离结果
• 2.3 不同病原菌与体细胞以及几种酶的关系
• 2.4 隐性乳腺炎体细胞数与几种酶的对数间的相关性
• 3. 讨论
• 3.1 有关奶牛隐性乳腺炎传统的诊断方法的比较
• 3.2 有关引起奶牛隐性乳腺炎的致病菌
• 3.3 有关体细胞数与乳腺炎病原菌的关系
• 3.4 几种酶在评估奶牛隐性乳腺炎的作用
• 3.5 奶牛隐性乳腺炎 SCC 和几种酶的相关性
• 第四章 奶牛临床型乳腺炎的治疗实验
• 1. 材料与方法
• 1.1 病例
• 1.2 治疗药物以及使用剂量
• 1.3 临床型乳腺炎的定义
• 1.4 临床检查和分组
• 1.5 临床操作要求
• 1.6 疗效判定标准
• 1.7 顽固性乳腺炎病原的分离与鉴定
• 2. 结果与分析
• 2.1 治疗效果
• 2.2 顽固性乳腺炎54 个乳区的细菌分离鉴定
• 2.3 顽固性乳腺炎的病例分析以及中药的治疗效果
• 3. 讨论
• 3.1 有关不同药物对临床型乳腺炎的治疗结果
• 3.2 有关中药治疗顽固性乳腺炎的思考
• 3.3 中药治疗奶牛乳房炎的前景展望
• 3.4 顽固型乳腺炎的菌群分析以及治疗
• 3.5 对奶牛乳腺炎治疗乳腺炎治疗不同给药途径与方法的思考
• 第五章 多重PCR 检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌，无乳链球菌，停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用
• 1. 材料与方法
• 1.1 参考菌株
• 1.2 引物
• 1.3 细菌 DNA 提取
• 1.4 乳样中细菌 DNA 的提取
• 1.5 PCR 条件的优化和 Mutiplex PCR 条件的优化
• 1.6 乳样中模拟细菌感染临床标本的制备和敏感性检测
• 1.7 临床乳样的来源与采集
• 1.8 乳样的细菌学培养与鉴定
• 1.9 多重 PCR 产物的鉴定
• 1.10 统计学方法
• 2. 结果
• 2.1 Mutiplex PCR 的特异性检测
• 2.2 Mutiplex：PCR 对4 种乳腺炎病原菌提取 DNA 的敏感性检测
• 2.3 用多重 PCR 和细菌学培养法对临床样品4 种主要致病菌的检测结果
• 2.4 多重 PCR 产物的测序分析
• 3. 讨论
• 3.1 用165 rRNA 与235 rRNA 之间的区域设计引物检验金黄色葡萄球菌，无如链球菌和停乳链球菌的可行性
• 3.2 用18 S rRNA 区域的保守序列设计引物检验酵母真菌的可行性
• 3.3 有关 Mutiplex PCR 方法检测的敏感性
• 3.4 Mutiplex PCR 方法与传统培养方法有不同结果的原因分析
• 4. 结论
• 第六章 乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素-1 的调查研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 细菌的来源
• 1.2 细菌的培养和模板的提取
• 1.3 引物的设计
• 1.4 PCR
• 1.5 ELISA
• 1.6 RPLA
• 1.7 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 PCR 对部分乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株的肠毒素基因和tst 基因的检测结果
• 2.2 PCR 对金黄色葡萄球菌肠毒素基因和tst 基因的检测
• 2.3 ELISA 对 PCR 阳性的金黄色葡萄球菌 SEA-SEE 肠毒素的检测结果
• 2.4 RPLA 对 PCR 阳性 SEA-SED 和 TSST-1 的检测结果
• 3 讨论
• 3.1 奶牛乳腺炎葡萄球菌肠毒素基因和tst 基因的流行情况
• 3.2 有关肠毒素的检测方法
• 3.3 有关 TSST-1
• 3.4 有关山羊乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素的流行情况
• 第七章 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌 Fnbp 和Cnap 基因的调查及 Fnbp 基因的克隆与原核表达
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 引物的设计与合成
• 1.3 PCR 模板 DNA 的获取
• 1.4 PCR
• 1.5 克隆载体的构建与鉴定
• 1.6 重组表达质粒的构建与鉴定
• 1.7 重组菌的诱导表达
• 1.8 蛋白的纯化以及 SDS-PAGE 蛋白电泳
• 1.9 表达重组蛋白的 Western-blotting 检测
• 2. 结果
• 2.1 测序
• 2.2 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的分子调查结果
• 2.3 重组表达载体质粒的PCR 与酶切结果
• 2.4 10A 菌株的 Fnbp 的氨基酸序列以及推导的核苷酸序列
• 2.5 Fnbp 蛋白的 SDS-PAGE
• 2.6 纯化蛋白的 Western-blotting 检测
• 3. 讨论
• 3.1 FnbD 基因和 Canp 基因在奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的存在情况
• 3.2 Fnbp 基因的克隆与原核表达
• 3.3 Fnbp 蛋白表面作为疫苗的可行性
• 第八章 金黄色葡萄球菌Fnbp 的纯化以及疫苗的田间免疫实验
• 1 材料
• 2. 方法
• 2.1 菌液的处理
• 2.2 表达蛋白的纯化—Ni-NTA 亲和层析
• 2.3 蛋白定量与冻干
• 2.4 Fnbp 表面蛋白疫苗的制备
• 2.5 实验动物的选择
• 2.6 免疫程序与方法
• 2.7 检测内容与方法
• 3. 结果
• 3.1 Fnbp 蛋白的纯化的 SDS-PAGE
• 3.2 纯化蛋白的定量
• 3.3 体温测定结果
• 3.4 实验牛奶产量的变化
• 3.5 免疫奶牛血清抗体滴度变化
• 4. 讨论
• 4.1 Fnbp 蛋白疫苗对奶牛体温和奶产量的影响分析
• 4.2 间接 ELISA 测抗体效价结果分析
• 4.3 还需进一步完成的工作
• 第九章 金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺组织以及肥大细胞数量的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 细菌的分离生化鉴定结果
• 2.2 乳腺组织的病理变化
• 2.3 乳腺内肥大细胞的分布与数目
• 3. 讨论
• 3.1 有关金黄色葡萄球菌引起乳腺的病理变化
• 3.2 有关肥大细胞以及意义
• 3.3 金黄色葡萄球菌对乳腺中肥大细胞数量的影响
• 第十章 结论
• 参考文献
• 附录
• 博士期间发表文章情况
• 致谢