黄瓜果实发育调控的分子机理研究

论文摘要

瓜类蔬菜是全世界范围内普遍栽培的重要作物,在生产上和消费上占有重要地位。它们多属雌雄异花同株植物,生产上尤其是设施栽培中的低温,弱光和高湿等因素很容易造成授粉受精不良,导致“化瓜”或者“畸形瓜”现象的产生,进而影响农业经济效益。因此,研究瓜类果实的座果和发育过程及其调控机制有助于加深我们对果实发育的理论认识,也有利于切实地解决生产中所存在的问题。本文以黄瓜（Cucumis sativus L.）栽培品种津春2号和4号为试材,研究了果实发育中细胞分裂,核内复制,细胞膨大的时空变化,分析了这些过程的分子调控基础及植物生长物质对其的影响。研究了BRs在果实发育中的作用和分子依据,在此基础上,研究了BRs对幼果RNA转录本的影响。同时,还研究了BRs和细胞分裂素在果实发育中对多胺代谢的影响。所得主要结果如下:1.研究了细胞分裂、核内复制及细胞周期相关基因表达在黄瓜果实发育中的变化及植物生长物质对其的影响。结果表明,细胞分裂在开花后4天（DAA）内非常旺盛,然后逐渐减慢到8 DAA基本停止。核内复制从4 DAA开始,伴随果实重量的增加而增加。核内复制的出现结合果实快速增长的开始表明果实中细胞膨大从开花后4 DAA开始,对果实不同部位的研究表明,核内复制主要发生在内果皮和果肉中。在6个细胞周期相关基因（CycA,CycB,CycD3;1,CycD3;2,CDKA和CDKB）中,两个分裂相关的周期蛋白基因（CycA和CycB）以及CDKB在2DAA内表达水平达到最高,而CycD3和CDKA的最高表达分别在4DAA和20DAA。奈乙酸（NAA）,N-（2-氯-4-吡啶基）-N’-苯基脲（CPPU）和表油菜素内酯（EBR）都能诱导黄瓜单性结实,加快细胞分裂和提高细胞周期相关基因的表达。相对而言,赤霉素（GA3）不能诱导单性结实,其对细胞分裂和细胞周期相关基因的表达作用也很小。2.研究了扩张蛋白（expansin）和木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XTHs）家族基因在黄瓜果实发育中的作用及其对植物生长物质的响应。结果发现,大部分expansin基因（CsExp3,5,6,7,8,9和10）的最高表达都出现在果实的快速细胞膨大期,表明这些基因在细胞膨大期起重要作用。CsExpl,4和XTH基因在分裂旺盛的果实发育前期表达较高,从而推测其在细胞分裂中的细胞壁修复和重建过程起重要作用。同时,这两个家族的大部分基因都在内果皮或者果肉中表达较高,也同样证明了它们在细胞膨大中的作用。不同expansin和XTH基因对四种不同的植物生长物质（NAA,EBR,CPPU和GA3）有着每个基因独特的响应机制。3.研究了油菜素内酯（BRs）在果实发育中的重要作用。在非单性结实的津春4号黄瓜栽培品种的子房上添加EBR可以诱导单性结实并且提高细胞分裂能力,而在单性结实的津春2号黄瓜栽培品种的子房上喷施BRs合成抑制剂（Brz）抑制果实生长,最终导致败育,而这种抑制现象可以通过添加EBR得以恢复。通过PCR克隆的方法,我们得到了CsCycD3;1和CsCycD3;2的cDNA序列,通过Northern杂交的方法发现,CsCycD3;1和CsCycD3;2的转录水平受EBR处理上调而强烈地被Brz处理抑制。同时,BR60xl和SMT（BRs合成相关基因）呈现反馈调节模式,从一定程度上说明了果实发育中BRs含量的变化。4.在BRs对黄瓜幼果RNA转录本影响的研究过程中,构建了黄瓜子房受EBR处理之后的消减抑制杂交（SSH）文库,共获得600个阳性克隆,在测序所得的132个cDNA序列中包含了118个非重复基因,根据BLASTX分析推测这些基因编码的蛋白功能,可以分为光合作用,蛋白合成,细胞分裂和分化,细胞膨大,代谢,胁迫响应和其它相关的7大类,其中参与细胞分裂调控的基因占最大比例,表明BRs参与调节了果实发育的多个过程,主要以调控细胞分裂为主。生长素和赤霉素响应基因在SSH文库中的出现,表明BRs可能与其它植物生长物质互作,共同作用于果实发育。14-3-3蛋白的出现,并且被EBR处理的高水平上调表明了14-3-3蛋白的信号途径可能在果实发育中起了重要作用。5.研究了多胺代谢在黄瓜果实发育中的变化模式以及BRs和CPPU对其的调控。结果表明,自由态多胺的含量和多胺合成酶基因的表达在果实发育前期较高,并且,多胺在细胞分裂旺盛的外果皮中分布较多,说明多胺主要在黄瓜果实发育的细胞分裂期起作用。在EBR和CPPU诱导的果实生长过程中,多胺的含量和基因的表达在发育早期也被显著提高,说明BRs和细胞分裂素在诱导果实生长过程中调节了内源多胺的代谢。此外,我们推测未授粉子房中多胺含量的保持和合成基因的高水平表达是因为多胺代谢在延缓子房的衰老中起了重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 缩略词表
• 目录
• 1 引言
• 1.1 果实发育概述
• 1.2 植物生长物质与果实发育
• 1.2.1 植物生长物质在果实发育中的作用
• 1.2.2 植物生长物质对单性结实的诱导作用
• 1.3 果实发育过程中的分子调节机制
• 1.3.1 细胞分裂与细胞周期相关基因
• 1.3.2 细胞膨大与expansin和XTH家族基因
• 1.4 BRs与植物生长发育
• 1.4.1 BRs和细胞分裂
• 1.4.2 BRs和细胞膨大
• 1.4.3 BRs和细胞分化
• 1.4.4 BRs与其它植物生长物质的互作
• 1.5 本文的研究目的
• 2 黄瓜果实发育中细胞分裂、核内复制和细胞周期相关基因表达的时空变化及植物生长物质对其的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 植物材料与处理
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 果实发育中生长量，倍性和细胞周期相关基因的表达变化
• 2.2.2 黄瓜果实不同组织中倍性和细胞周期相关基因表达的空间变化
• 2.2.3 植物生长物质对果实生长和细胞周期相关基因表达的调节
• 2.3 讨论
• 3 黄瓜果实发育中expansin和XTH家族基因表达的时空变化和对植物生长物质的响应
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与处理与第二章同
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 果实发育中细胞膨大及黄瓜expansin和XTH基因表达的变化
• 3.2.2 果实不同组织的倍性和expansin及XTH基因的表达
• 3.2.3 植物生长物质对expansin和XTH基因表达的影响
• 3.3 讨论
• 4 油菜素内酯（BRs）在黄瓜果实发育中的作用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料和处理
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 果实发育，细胞分裂和核内复制情况
• 4.2.2 D3细胞周期蛋白基因的克隆
• 4.2.3 CycD3基因的Northern分析
• 4.2.4 BR合成基因的表达
• 4.3 讨论
• 5 BRs对黄瓜幼果RNA转录本的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与处理
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 黄瓜幼果中BRs上调基因的筛选
• 5.2.2 BRs上调基因的分析
• 5.2.3 RT-PCR分析SSH文库中基因的表达
• 5.3 讨论
• 6 果实发育中BRs和细胞分裂素对多胺合成代谢的调节
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料与处理
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 EBR和CPPU处理对黄瓜生长的影响
• 6.2.2 授粉和植物生长物质处理对黄瓜果实中自由态多胺含量的影响
• 6.2.3 授粉和植物生长物质处理对黄瓜多胺合成基因表达的影响
• 6.3 讨论
• 7 结论
• 参考文献
• Abstract
• 发表论文