论文摘要
动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是世界上死亡率最高的疾病之一,无论是在发展中国家还是在发达国家,主要表现为病变组织中胆固醇的堆积,并伴有大量泡沫细胞的形成。ATP结合盒转运子A1（ ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1）是一个抗AS基因,它能促进细胞中胆固醇的流出,并抑制AS的发生发展。人的ABCA1基因定位于9q3.1,包括了50个外显子和49个内含子,编码2261个氨基酸残基。它在人的许多组织都高表达,如胚胎、肝、肾上腺、肺和胎儿组织。巨噬细胞中胆固醇流入能上调它的表达,而HDL3介导的胆固醇流出则能抑制其表达。ABCA1缺乏能导致丹吉尔病和家族性HDL缺乏症,表现为胆固醇酯在各种组织中聚集。在脂质负荷的巨噬细胞中ABCA1表达增高,能促进细胞内的胆固醇流出到胞外的载脂蛋白AI或者HDL上。作为胆固醇逆转运过程的第一步,ABCA1的激活还能调节与AS发生关系密切的血浆HDL的浓度。过氧化物酶体增殖激活性受体（Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs）是一种调控脂质和糖类代谢的核受体,包括PPARα, PPARβ（σ）和PPARγ三种亚型。PPARα在肝脏、心脏、肌肉、肾脏和动脉管壁的各种细胞如内皮细胞和巨噬细胞中表达较高。PPARβ表达广泛,但是至今仍没有发现有特定的配体,目前的研究很少。PPARγ高表达于白色脂肪组织、免疫系统和小肠中。PPARs在和其配体结合后,PPARs的转录活性会发生改变,继而与另一种核受体视黄醇类X受体（retinoid X receptor,RXR）结合形成异二聚体,从而作为配体激活的转录调节基因发挥作用。现有大量研究指出PPARs具有抗AS的作用。LXRs也是核受体超家族的一员,在调节脂质代谢的过程中起着关键的作用。LXRs对细胞内胆固醇的升高非常敏感,胆固醇浓度的升高会激活LXRs,进而诱导一系列参与胆固醇吸收、流出和转运的基因发生表达。除了参与脂质代谢的功能,LXRs还能在巨噬细胞中调节免疫和炎症反应。它分为LXRα和LXRβ两种亚型。LXRs一般与RXR生成异二聚体,识别并结合特异性DNA反应元件而发挥作用。基因表达证实LXRα能调节肝脏、巨噬细胞和小肠内胆固醇和脂肪酸代谢中大量的靶基因。LXRα高表达于代谢旺盛的组织如肝脏,且能被脂肪酸所调节,这些都指出LXRα在脂质代谢中的作用非常重要。本实验以THP-1源性巨噬细胞为研究对象,研究PPARα激动剂氯贝丁酯（clofibrate）对THP-1源性巨噬细胞LXRα表达的影响;并进一步研究了氯贝丁酯和PPARγ的激动剂曲格列酮（troglitazone）,对THP-1源性巨噬细胞中ABCA1表达及胆固醇流出的影响,从而探讨PPARs激动剂在AS防治中的作用机制。本研究主要结果总结如下:1.用一次性密度梯度超速离心法从人新鲜血清中分离了高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）。并用二价铜离子诱导LDL氧化,得到氧化型LDL（ox-LDL）,用0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定HDL、LDL和ox-LDL。2.人THP-1单核细胞在使用200nmol/L佛波酯（PMA）作用48小时后诱导生成巨噬细胞。用PPARα激动剂氯贝丁酯刺激巨噬细胞不同时间（0, 4, 8, 12和24小时）后,采用RT-PCR法发现LXRαmRNA水平表达随着氯贝丁酯作用时间的延长而具有时间依赖型的表达增加;采用Western Blot法分析得到巨噬细胞中LXRα的蛋白质表达也随着氯贝丁酯作用时间延长而时间依赖型的表达增加。3.用PPARα激动剂氯贝丁酯和PPARγ激动剂曲格列酮分别作用巨噬细胞0, 4, 8, 12和24小时后,采用半定量RT-PCR和Western Blot法得出巨噬细胞中ABCA1 mRNA水平和蛋白质水平表达均随着氯贝丁酯或曲格列酮作用时间的延长而表达增加,且表现为时间依赖型。4.用50mg/L ox-LDL和0.2mCi/L [3H]标记的胆固醇负荷THP-1源性巨噬细胞24小时后,使之诱导形成泡沫细胞,采用胆固醇流出实验检测氯贝丁酯和曲格列酮刺激泡沫细胞的胆固醇流出率。证实在氯贝丁酯和曲格列酮分别作用0, 4, 8, 12和24小时后泡沫细胞的胆固醇流出均有增加,且都表现为时间依赖型的增加。实验证实PPARα激动剂氯贝丁酯能时间依赖性的上调LXRα的表达,同时实验还证实PPARα激动剂氯贝丁酯和PPARγ的激动剂曲格列酮分别在mRNA水平和蛋白质水平能上调ABCA1的表达,并能促进THP-1源性泡沫细胞胆固醇流出,从而探讨PPARs激动剂在AS防治中的作用。