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家蚕核型多角体病毒FGF 的细胞和组织定位研究

2020-11-22阅读(1006)

家蚕核型多角体病毒FGF 的细胞和组织定位研究

论文摘要

成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factors,FGFs）大都发现于脊椎动物（包括人）,是一种具有广泛生物活性的蛋白分子。已有研究表明,FGFs对机体发育、组织的结构与功能的维持、损伤的愈合与修复都有作用,还与肿瘤的发生和转移等多种病理过程有关。本研究分离纯化了柞蚕多角体病毒（Antheraea pernyi nuclear polyhedrin virus,ApNPV）,并在对该病毒DNA序列分析时,发现了一个与人源fgf基因相似的基因。该基因存在于所有已公布的杆状病毒全序列中,但功能未知。为了解该基因在病毒感染中所起的作用,本文在家蚕—杆状病毒的模型中对fgf基因进行了初步研究,包括对家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrin virus,BmNPV）的fgf基因进行了克隆、表达和功能的研究,主要结论如下: 1.克隆了柞蚕多角体病毒ApNPV中的fgf基因。该基因大小为558bp,其读码框含有185aa,是一个新基因。该基因已在GenBank上登录（登录号为AY641527）。 2.克隆和表达了家蚕核型多角体病毒中fgf基因。构建了原核表达载体pET28a-fgf,通过IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示在27kDa左右有一特异条带,与预测的蛋白质分子量大小一致。该蛋白在大肠杆菌中含量较高并以包涵体的形式存在,表达产物含有6个组氨酸残基,用Ni-NTA亲和层析柱高效纯化了表达产物。 3.以绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）作为融合基因,构建真核表达载体pCDNA3.1-gfp-fgf。该基因在高等哺乳动物细胞COS-7细胞中表达,并定位在细胞核内,可能影响COS-7细胞中DNA复制或基因的转录。 4.杆状病毒表达系统中,FGF在不同细胞系中表达定位不尽相同。构建重组转座载体Bacmid-gfp-fgf DNA,转染细胞获得重组病毒Ac-gfp-fgf,分别感染TN5和Sf9细胞使FGF在这两种细胞中过量表达,发现该蛋白定位于细胞膜。构建重组转移载体pBacPAK8-gfp-fgf与线性化的Bm-pBacPAK6 DNA共转染BmN细胞,该蛋白定位于BmN细胞的细胞核中。FGF在不同细胞中定位不同,

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 目录
  • 缩写与符号
  • 第1章 绪论
  • 1.1 成纤维细胞生长因子（FGF）的研究进展
  • 1.1.1 fgf基因的组成
  • 1.1.2 FGFs的分子结构特征
  • 1.1.3 FGF受体（FGFR）
  • 1.1.4 FGF的功能
  • 1.2 杆状病毒的分子生物学研究
  • 1.2.1 杆状病毒分类
  • 1.2.2 杆状病毒基因研究概况
  • 1.2.3 杆状病毒表达系统
  • 1.2.4 杆状病毒生物杀虫剂
  • 1.3 本课题研究的意义目的和内容
  • 1.3.1 本研究的意义
  • 1.3.2 本研究的目的
  • 1.3.3 本研究的主要内容
  • 第2章 柞蚕核型多角体病毒fgf基因的克隆和序列分析
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.2 ApNPV多角体的纯化及 DNA提取
  • 2.1.3 ApNPVDNA的Hind Ⅲ和Sal Ⅰ基因组文库的构建
  • 2.1.4 fgf全长基因克隆
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 fgf基因序列的解析
  • 2.2.2 fgf基因的序列分析与同源性比较
  • 2.3 本章小结
  • 第3章 家蚕核型多角体病毒fgf基因的克隆与序列分析
  • 3.1 材料和方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 常用缓冲液
  • 3.1.3 主要仪器设备
  • 3.1.4 引物设计与合成
  • 3.1.5 BmN细胞中杆状病毒BmNPV DNA的提取
  • 3.1.6 fgf类似基因的PCR
  • 3.1.7 连接反应
  • 3.1.8 感受态细胞制备
  • 3.1.9 质粒 DNA转化
  • 3.1.10 SDS-碱裂解法小量抽提质粒 DNA
  • 3.1.11 fgf基因的克隆和分析
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 PCR结果
  • 3.2.2 酶切鉴定结果
  • 3.2.3 P12，P34测序结果
  • 3.2.4 BmNPV中fgf基因的序列比较
  • 3.3 本章小结
  • 第4章 家蚕核型多角体病毒fgf基因在大肠杆菌中的表达
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 常用缓冲液
  • 4.1.3 主要仪器
  • 4.1.4 pET28a（+）-fgf表达载体的构建
  • 4.1.5 fgf基因在大肠杆菌中的表达
  • 4.1.6 SDS-PAGE分析鉴定表达产物
  • 2+-IDA亲和层析)'>4.1.7 表达产物的纯化(Ni2+-IDA亲和层析)
  • 4.2 结果和分析
  • 4.2.1 pET28a（+）-fgf表达载体的构建
  • 4.2.2 重组质粒酶切及 PCR鉴定结果
  • 4.2.3 SDS-PAGE分析鉴定表达产物
  • 4.2.4 重组蛋白的纯化
  • 4.3 本章小结
  • 第5章 家蚕核型多角体病毒fgf基因在真核细胞中表达和定位
  • 5.1 材料和方法
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 主要实验仪器
  • 5.1.3 引物设计和合成
  • 5.1.4 pCDNA3.1-gfp-fgf表达载体的构建
  • 5.1.5 fgf基因在真核细胞中的表达
  • 5.2 结果和分析
  • 5.2.1 pcDNA3.1-gfp-fgf表达载体的构建
  • 5.2.2 重组质粒酶切及 PCR鉴定结果
  • 5.2.3 共聚焦观察转染的细胞
  • 5.3 本章小结
  • 第6章 家蚕核型多角体病毒fgf基因在昆虫细胞中表达和定位
  • 6.1 材料和方法
  • 6.1.1 质粒、菌种与细胞
  • 6.1.2 酶及主要试剂
  • ASTBACHTB-gfp-fgf构建与鉴定'>6.1.3 质粒pFASTBACHTB-gfp-fgf构建与鉴定
  • 6.1.4 转座重组杆状病毒 Bacmid/gfp-fgf质粒
  • 6.1.5 Bacmid/gfp-fgf的PCR检测鉴定
  • 6.1.6 重组 Bacmid转染昆虫细胞
  • 6.1.7 PCR分析外源基因与病毒基因组的整合
  • 6.1.8 SDS-PAGE
  • 6.1.9 fgf在Sf9细胞中的表达
  • 6.2 结果
  • ASTBACHTB-gfp-fgf构建'>6.2.1 重组质粒pFASTBACHTB-gfp-fgf构建
  • 6.2.2 重组质粒酶切及 PCR鉴定结果
  • 6.2.3 PCR鉴定 Bacmid/gfp-fgf转座重组
  • 6.2.4 共聚焦观察细胞 TN5细胞
  • 6.2.5 重组杆状病毒的PCR检验
  • 6.2.6 SDS-PAGE电泳检验
  • 6.2.7 荧光显微镜观察病毒感染的 Sf9细胞
  • 6.3 本章小结
  • 第7章 家蚕核型多角体病毒fgf基因在家蚕细胞和幼体中表达和组织定位
  • 7.1 材料与方法
  • 7.1.1 材料
  • 7.1.2 重组杆状病毒转移载体的构建
  • 7.1.3 线性化的 Bm-pBacPAK6 DNA的制备
  • 7.1.4 Lipofectin共转染
  • 7.1.5 SDS-PAGE电泳
  • 7.1.6 fgf基因在蚕体中的表达定位
  • 7.2 结果与分析
  • 7.2.1 重组转移载体的构建
  • 7.2.2 重组转移质粒的酶切检验与 PCR检验
  • 7.2.3 荧光显微镜观察病毒感染的Bm细胞
  • 7.2.4 SDS-PAGE电泳检验
  • 7.2.5 fgf基因在蚕体中表达的定位
  • 7.3 本章小结
  • 第8章 全文总结及工作展望
  • 8.1 主要结论
  • 8.2 存在问题及工作展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 在学期间发表论文

    • 相关论文文献

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