玉米S-CMS核育性恢复基因Rf3的精细定位及其候选基因的筛选

论文摘要

植物杂种优势的利用推动了农作物产量、品质的大幅度提高。玉米是世界上最早将CMS及育性恢复系统应用于杂种优势育种的作物之一。CMS及育性恢复（restorer of fertility，Rf）系统为实践中杂交种的生产提供了巨大的便利，不仅能节省大量人工去雄，而且可减少因去雄不净所造成的混杂，充分发挥杂种优势的作用；同时CMS是研究核质互作分子机理的重要模式性状。玉米S-CMS系的育性由线粒体上育性相关基因和核基因（Rf3／rf3）共同决定。S组CMS是玉米三个主要细胞质雄性不育组群中最大的一个组，其育性表现较不稳定，影响了其在育种实践中的应用。为了进一步发挥玉米S-CMS在杂优利用中的作用，克隆育性恢复基因Rf3并阐明育性恢复机理显得尤其重要。图位克隆是一种有效的基因克隆方法，其成功的基础需要有目标基因区域高分辨率的遗传图谱，前人对核育性恢复基因Rf3已进行了定位，但所定位的遗传图距较远，远不能满足图位克隆的需要。本研究拟在本室前期对玉米S-CMS研究的基础上，以Rf3／rf3近等基因系S-MO17Rf3Rf3／S-MO17rf3rf3为材料，利用近等基因系间Rf3区段的分子标记信息，结合AFLP分子标记开发技术对Rf3进行精细定位，筛选与其紧密连锁或共分离的分子标记。同时利用cDNA-AFLP技术，在转录水平上研究近等基因系S-MO17Rf3Rf3／S-MO17rf3rf3不同发育时期基因的差异表达谱，以期鉴定玉米S-CMS育性恢复相关基因。主要研究结果如下：1．为开展玉米S-型细胞质雄性不育核恢复基因的精细定位，选用恢复基因近等基因系（NIL）材料构建回交一代群体(S-Mo17rf3rf3×S-Mo17Rf3Rf3)×N-Mo17rf3rf3。对所有单株进行田间花粉观察与室内镜检，二者结果一致，BC1F1群体中178株被划分为可育株；165株为不育株，符合1：1分离比，在本研究材料中该育性恢复性状受一对基因控制。2．选用Rf3所在的2.09bin区域的13对SSR标记进行双亲间多态性筛选，结果表明，仅标记UMC2184在双亲的2.09bin区间存在多态性，该标记被用于鉴定分析群体中的基因型并作为其它标记的锚定位点。采用EcoRI+MseI、PstI+MseI及EcoRI+PstI三种酶切方式共528对选择性扩增引物组合在双亲及DNA池中进行AFLP分析，共产生大约29，000条带纹。选择差异性引物组合进一步对可育／不育两DNA池的单株DNA进行检测，最终发现E3P1、E7P6、E10P7及E12M7共4个标记在个体中的带型与相应亲本一致，其序列相互不重复，代表4个不同的片段，作为候选的紧密连锁标记进一步在BC1F1群体中检测基因型。3．回收标记E3P1、E7P6、E10P7及E12M7对应的差异扩增片段，最终将AFLP标记E3P1及E12M7分别转化为共显性标记CAPSE3P1及显性标记SCARE12M7。4．用筛选、验证所得到的一个SSR标记UMC2184、2个AFLP标记E7P6、E10P7及2个基于PCR的标记SCARE12M7、CAPSE3P1构建了恢复基因Rf3区域的遗传连锁图，图谱全长11.1cM，平均间距为2.22cM。将Rf3定位于AFLP标记E7P6与SCAR标记SCARE12M7之间，遗传图距分别为0.9cM和1.8cM。为恢复基因Rf3的图位克隆奠定了基础。5．对分子标记SCARE12M7序列进行BLASTx分析及相关图谱比较，发现其与已定位的玉米抗丝黑穗病QTL紧密连锁或共分离。讨论了该标记用于玉米S-CMS育性恢复及丝黑穗抗性双性状聚合选择的潜力的可能性。6．利用64对引物组合对S-Mo17rf3rf3和S-Mo17Rf3Rf3苗期叶片及抽雄早期花粉进行cDNA-AFLP分析。共显示TDFs约2500条，片段大小介于80-800bp之间。其中差异表达片段分为质的表达差异和量的表达差异两种类型。质的差异表达带纹共122条，分为7大类型。对在恢复系叶片和花粉中表达但在不育系中沉默和仅在恢复系花粉中表达的33条片段进行序列分析和同源性比较，发现其分别代表：蛋白质降解与贮存相关基因3个，约占9％；转录调控相关基因5个，约占15％；信号转导相关基因4个，约占12％；能量代谢相关基因3个，约占9％；细胞生长与分裂相关基因3个，约占9％；转座子相关基因1个，约占3％；未知蛋白编码基因9个，约占28％；新发现的序列5个，约占15％。其中26S proteasome regulatory particle与本室前期利用cDNA芯片的研究结果表现相同的表达趋势。用电子拼接及在基因组cDNA中扩增、测序验证：该基因全长1329bp，编码443个氨基酸组成的多肽。经Clustal W比较分析，玉米26S proteasome regulatory subunit与水稻、拟南芥、人类中同源蛋白质序列相似性分别达91％、77％、41％。7．在已测序的差异表达片段中，与转录调控相关的基因占15％；对序列E1同源性搜索发现：其代表基因编码蛋白包含PPR模体。对该基因在恢复系及不育系苗期叶片、抽雄期叶片、抽雄期花粉、苗期根4个材料进行RT-real-time PCR分析，结果表明：该基因在不育系和恢复系两种材料的不同组织部位存在明显的表达模式差异，在可育材料的抽雄期花粉中，该基因表达量最高，为幼苗叶片及抽雄期叶片表达量的4倍，在根部表达量达到最低；而在不育材料抽雄期花粉中表达量比抽雄期叶片略低，为幼苗叶片表达量的2倍，根部表达量为最低水平。研究结果暗示该PPR相关基因可能与育性恢复有关。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 玉米细胞质雄性不育及育性恢复的遗传基础研究
• 1.1.1 玉米细胞质雄性不育的分类
• 1.1.2 玉米细胞质雄性不育的分子生物学研究
• 1.1.3 CMS育性恢复基因克隆及育性恢复机理的假说
• 1.2 植物分子标记开发研究进展
• 1.2.1 利用数据库序列信息和生物信息学手段开发新的分子标记
• 1.2.2 利用分子生物学实验技术开发新的分子标记
• 1.3 基因差异表达分析法
• 1.3.1 差异显示PCR法
• 1.3.2 消减杂交法
• 1.3.3 基因芯片技术
• 1.3.4 cDNA-AFLP技术
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 花粉育性鉴定
• 2.3 玉米基因组总DNA的抽提纯化及DNA池的创建
• 2.4 分子标记分析
• 2.4.1 SSR标记分析
• 2.4.2 RAPD标记分析
• 2.4.3 AFLP标记分析
• 2.5 AFLP标记向单位点PCR标记的转化
• 2.5.1 目标差异片段的回收、克隆及测序
• 2.5.2 SCAR标记的获得
• 2.5.3 CAPS标记的获得
• 2.6 遗传连锁分析
• 2.7 幼穗小孢子及花粉的分离
• 2.8 总RNA抽提及mRNA分离
• 2.9 双链cDNA的合成
• 2.10 cDNA-AFLP分析
• 2.11 差异表达片段的回收、克隆及测序
• 2.12 序列分析及引物设计
• 2.13 全长cDNA的电子克隆及RT-PCR验证
• 2.14 Real-time PCR
• 3 结果与分析
• 1F₁群体花粉育性调查及遗传分析'>3.1 BC₁F₁群体花粉育性调查及遗传分析
• rf3rf3及S-Mo17^Rf3Rf3间多态性分子标记的筛选'>3.2 亲本S-Mo17^rf3rf3及S-Mo17^Rf3Rf3间多态性分子标记的筛选
• 3.2.1 SSR标记的筛选
• 3.2.2 RAPD标记的筛选
• 3.2.3 AFLP标记的筛选
• 3.2.4 AFLP标记向单位点PCR标记的转化
• 3.3 遗传连锁分析
• 3.4 基于cDNA-AFLP的近等基因系间不同组织相关基因的差异表达分析
• 3.4.1 RNA的提取及双链cDNA的合成
• 3.4.2 cDNA-AFLP筛选差异表达基因片段
• 3.4.3 差异表达基因片段的回收、克隆和序列分析
• 3.4.4 蛋白质降解相关基因的分析
• 3.4.5 PPR相关基因表达分析
• 4 讨论
• 4.1 利用近等基因系及分离群体分组分析法筛选紧密连锁标记的有效性
• 4.2 AFLP分析技术筛选紧密连锁分子标记的有效性
• 4.2.1 AFLP与RAPD技术对筛选分子标记效率的比较
• 4.2.2 AFLP低频酶切组合与高低频内切酶混合的比较
• 4.2.3 对于AFLP标记转化为单位点PCR标记方法的探讨
• 4.3 与恢复基因紧密连锁分子标记的应用价值
• 4.3.1 分子标记辅助选择（MAS）选育恢复系的有效性探讨
• 4.3.2 对标记SCARE12M7同时选择抗丝黑穗病和育性恢复性状潜力的探讨
• 4.3.3 对利用单位点标记进行杂交种纯度鉴定的探讨
• 4.3.4 利用Rf3紧密连锁标记染色体步移，实现图位克隆的可行性分析
• 4.4 玉米S-CMS育性恢复机理探讨
• 4.4.1 细胞凋亡抑制与育性恢复
• 4.4.2 可育与败育花粉发育过程中PPR相关基因差异表达
• 4.5 克隆Rf3基因的下一步工作建议
• 参考文献
• 附录1 玉米总DNA的提取及纯化
• 附录2 SSR分析操作方法及试剂配制
• 附录3 AFLP Procedure
• 附录4 玉米雄花育性的分级标准
• 附录5 RNA and mRNA isolation
• 附录6 Resume of author
• 致谢