论文摘要
目的雌激素通过雌激素受体（Estrogen receptor, ER）介导参与骨代谢过程。自从雌激素受体β（Estrogen receptor beta, ERβ）被发现后,人们对雌激素的作用方式产生了全新的认识,这一发现为研究雌激素受体在骨代谢中作用机制开辟了新的途径。此外,由成骨细胞与破骨细胞执行的骨形成与骨吸收贯穿于骨代谢的全过程。而表达于成骨细胞表面的OPG/RANKL系统在阐明骨代谢发生机制方面具有重要意义,特别是OPG/RANKL比率的改变可以影响骨吸收和骨形成,从而影响骨代谢。本研究的主要目标包括：①构建针对人ERβ基因逆转录病毒介导的RNA干扰（RNAi）表达载体pRNAT-H1.4/Retro-shRNA并包装成逆转录病毒。②将其转染人成骨样细胞株MG63,观察其对人成骨样MG63细胞中ERp基因表达的影响。③构建人成骨样细胞ERβ基因敲低细胞模型并观察在雌激素干预下ERp表达受抑后对人成骨样MG63细胞株的OPG/RANKL比值的影响。为探讨ERβ基因如何调节骨代谢提供新的理论基础。方法①根据GeneBank数据库提供的ERβ基因核苷酸序列,选择设计3条针对人ERβ干扰靶序列,再转化为能表达其小发夹结构RNA（small hairpin RNAs, shRNA）的DNA序列,并与pRNAT-H1.4/ Retro质粒定向连接,构建真核表达载体pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。将pRNAT-H1.4/ Retro-ERβ-shRNA经脂质体转染至293细胞包装成逆转录病毒。②对体外培养的MG63细胞进行形态学观察及苔盘兰-瑞氏染色。将包装好的逆转录病毒,以空白及非特异性shRNA （shRNAnc）作为对照,感染人成骨样MG63细胞株,用流式细胞仪检测感染效率,然后各组于转染48h后收集细胞分别抽提RNA及蛋白,半定量RT-PCR法检测细胞中ERβmRNA表达水平的改变,Western blot法检测ERp蛋白表达的变化,从而筛选最有效的干扰序列。③将含有最有效干扰序列及非特异性shRNA的逆转录病毒分别感染人成骨样MG63细胞株后,筛选稳定克隆并扩大培养,以空白及非特异性shRNA作为对照,半定量RT-PCR法及Western blot法检测稳定抑制ERp的效率；MTT法测定RNAi干扰ERp后对人成骨样MG63细胞增殖的影响；然后分别向三组细胞即MG63细胞、ERpshRNA逆转录病毒感染的MG63细胞、阴性对照shRNAnc逆转录病毒感染的MG63细胞加入10-8mol/L的17β-雌二醇（E2）干预,48h后收集细胞,分别抽提RNA及蛋白。应用半定量RT-PCR法、Western blot法检测人成骨样细胞株MG63的OPG、RANKL mRNA和蛋白表达情况。用SPSS 13.0统计学软件进行分析,计量资料统计结果以均数±标准差表示,经方差齐性检验,组间进行单因素方差分析（One way ANOVA）后,再用LSD法进行多个样本均数间的显著性检验,检验水准α=0.05。P值<0.05表示显著性差异。结果①针对人ERβ分别构建了3种shRNA逆转录病毒载体：pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA1, pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA2, pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA3。重组质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对ERp基因的目的序列,表明重组质粒构建成功。并经脂质体转染至293细胞后成功包装成逆转录病毒。②感染结果显示,逆转录病毒载体能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞株,感染效率为70%左右。瞬转的结果表明：3种shRNA逆转录病毒载体对人成骨样MG63细胞株的ERβmRNA抑制率分别为44.77±5.41%、61.21±4.47%、80.11±1.72%,蛋白抑制率分别为44.84±0.96%、62.52±1.02%、81.18±0.73%（均P<0.05）。其中pRNAT-H 1.4/Retro-ERβ-shRNA3对人成骨样MG63细胞株的ERp抑制效率最高。③用pRNAT-H1.4/Retro-ER(3-shRNA3进一步稳转人成骨样MG63细胞株,与空白及阴性病毒对照组相比,筛选出ERβ表达稳定抑制的人成骨样细胞株,ERpmRNA抑制率为88.17±1.17%（P<0.05）,蛋白抑制率为89.01±1.22%（P<0.05）。MTT法显示RNAi干扰ERp后人成骨样MG63细胞增殖未见明显变化。雌激素干预48h后,显示ERp稳定抑制的MG63细胞较空白组及阴性对照组OPG mRNA上调15.51±1.72%,蛋白表达上调20.35±1.15%（P<0.05）,RANKL mRNA下调22.17±0.94%,蛋白表达下调27.22±1.48%（P<0.05）,OPG/RANKL表达上调（P<0.05）。结论①应用pRNAT-H1.4/Retro载体成功构建了3种pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA逆转录病毒载体并包装成pRNAT-H1.4/Retro-ERp-shRNA逆转录病毒。②包装后的3种ERβ-shRNA逆转录病毒均能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞,并显著抑制ERp的表达。其中以ERβ-shRNA3为最佳的干扰序列。③成功建立了人成骨样细胞雌激素受体p亚型基因敲低细胞模型。并发现在雌激素干预下通过利用RNAi沉默ERp基因后可上调人成骨样MG63细胞OPG mRNA和蛋白表达、下调RANKL mRNA和蛋白表达,上调OPG/RANKL表达,从而提示ERp可能通过调节OPG/RANKL在骨代谢中发挥作用。