苦马豆素人工抗原的合成及其免疫原性研究

论文摘要

疯草是豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称,是世界范围内危害草原畜牧业生产最严重的一类毒草,可导致中毒动物消瘦、神经症状、死亡,母畜不孕或流产、畸胎、死胎,公畜不育等,并给草原畜牧业生产造成了巨大损失。目前应用的防除方法主要包括人工挖除、化学灭除和生物防除等。这些方法的应用与实施对减少动物中毒所造成的损失产生了巨大的作用。但疯草在干旱年份和季节,生长更加旺盛,成为我国西部草场上的优势牧草,在固沙、保持草场生物量等方面具有较大潜力。其主要有毒生物碱成分——苦马豆素（swainsonine, SW）在医学研究和临床尤其是在抗癌方面的潜在应用价值的发现更引起人们的广泛关注,使疯草的防除与保护利用之间的矛盾日益突出。免疫学预防方法为解决这一矛盾展示了诱人的前景。但由于SW分子量小,不包含与BSA等蛋白载体连接的化学基团,其人工抗原的合成程序复杂。为了进一步简化合成程序,提高产率,增强人工抗原的免疫原性,本研究探索设计出2条SW人工抗原合成路线,建立了抗SW抗体的间接ELISA检测方法,通过免疫试验证明了合成的人工抗原的免疫原性。获得了如下结果:1.在超声提取的基础上,采用液-液萃取和升华结晶,自甘肃棘豆中提取SW,提取率达到45 mg/kg。2.依据芳香基可在紫外光下显示荧光的特性,以及具有芳香环结构的抗原免疫原性大于直链脂肪酸的特点,在半抗原与载体蛋白连接的“臂”中引入芳香基团,设计出2条新的合成路线,制备出SW人工抗原合成的关键中间产物。合成路线Ⅰ:首先将对氯甲基苯甲酸与碳酸钠或碳酸氢钠反应制备对氯甲基苯甲酸钠,然后和SW反应,合成氯化N-（4-羧基苯甲基）苦马豆素铵（N-（4-carboxybenzyl） swainsonine chloride,简称关键中间产物）。合成路线Ⅱ:酸性条件下,首先将对氯甲基苯甲酸与甲醇反应,生成对氯甲基苯甲酸甲酯,再与SW在有机溶剂中反应,生成氯化N-（4-羧酸甲酯基苯甲基）苦马豆素铵（N-（4-carboxymethylesterbenzyl） swainsonine chloride）,再加入NaOH脱酯,继而调节反应体系至酸性,生成关键中间产物,最后通过柱层析分离纯化。通过MS、1H NMR和13C NMR等波谱的综合分析,鉴定合成产物的结构。结果证明设计的2条合成路线可行,能通过薄板层析与荧光检测并结合SW显色反应对合成的关键步骤进行即时检测。与合成路线Ⅰ相比,路线Ⅱ进一步减少了纯化过程,程序简单,提高了产物的均一性,关键中间产物的产率达到79%,适于大量制备。应用EDC法将合成的关键中间产物与BSA缩合连接,制备出SW人工抗原,按BSA计算,产率为95%,两次合成的人工抗原中SW与BSA的结合比分别为14.7:1和20∶1。3.用SW人工抗原（SW-BSA）免疫小鼠,制备抗SW血清,建立了一种敏感性高,特异性强,稳定性高的抗SW抗体间接ELISA检测方法,证明其最适条件为:以1.0μg?mL SW-OVA作为包被抗原,于4℃包被过夜或37℃包被2 h,封闭剂选用15 g/L的明胶,酶标抗体的工作浓度1:1500。4.应用制备的SW-BSA免疫小鼠和家兔,证明所制备的SW人工抗原具有良好的免疫原性,免疫后小鼠和家兔血清中针对SW的抗体ELISA效价均达到1:2000。上述结果为SW人工抗原疫苗的制备提供了新的途径,为生物样品中SW的含量测定以及相关研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 动物疯草中毒与苦马豆素研究进展
• 1.1 疯草中毒病的发生
• 1.2 疯草的种类与分布
• 1.3 疯草的危害
• 1.3.1 引起家畜中毒死亡
• 1.3.2 影响繁殖
• 1.4 疯草中毒的临床表现
• 1.5 疯草中毒的病理变化
• 1.5.1 尸体剖检变化
• 1.5.2 病理组织学变化
• 1.5.3 血、尿生化指标和酶学指标的变化
• 1.6 疯草的有毒成分
• 1.6.1 脂肪族硝基化合物
• 1.6.2 硒化合物
• 1.6.3 苦马豆素（SW）
• 1.6.4 其它生物碱
• 1.7. SW 引起动物中毒的机理
• 1.8 疯草中毒的预防
• 1.8.1 疯草的防除
• 1.8.2 控制家畜对疯草的采食量
• 1.8.3 疯草的脱毒利用
• 1.8.4 药物预防
• 1.8.5 毒素的微生物降解
• 1.8.6 免疫预防
• 1.9.SW 研究进展
• 1.9.1 SW 的结构与理化性质
• 1.9.2 SW 的来源
• 1.9.3 SW 的生物学活性
• 1.9.4 SW 的抗肿瘤作用
• 1.9.5 SW 的代谢动力学
• 1.9.6 SW 的分析检测方法
• 1.10.SW 人工抗原制备
• 1.11. 疯草和 SW 的研究展望与存在的问题
• 1.11.1 疯草的防除
• 1.11.2 疯草中毒的预防
• 1.11.3 SW 的研究
• 试验研究
• 第二章 SW 的提取与SW 人工抗原的合成Ⅰ
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 SW 的提取
• 2.1.3 SW-BSA 人工抗原的合成
• 2.1.4 SW-BSA 人工抗原中SW/BSA 结合比的测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 SW 的提取结果
• 2.2.2 对氯甲基苯甲酸钠的合成
• 2.2.3 化合物2 —关键中间产物的检测
• 2.2.4 SW-BSA 的合成
• 2.2.5 SW-BSA 中SW 与BSA 的摩尔比
• 2.3 讨论
• 2.3.1 SW 的提取
• 2.3.2 SW 人工抗原的合成
• 2.3.3 SW 人工抗原的结构
• 2.3.4 SW-BSA 中SW 与BSA 的摩尔比
• 小结
• 第三章 SW-BSA 人工抗原的合成Ⅱ
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 合成产物的鉴定结果
• 3.2.2 化合物3（SW-BSA）的合成
• 3.2.3 SW-BSA 中SW 的结合比
• 3.3 讨论
• 小结
• 第四章 抗SW 抗体ELISA 检测方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 小鼠抗SW 血清的制备
• 4.1.3 间接ELISA 的操作
• 4.1.4 酶标抗体最适稀释度的确定
• 4.1.5 包被抗原SW-OVA 最适浓度以及封闭剂的确定
• 4.1.6 ELISA 检测小鼠血清的重复性试验
• 4.1.7 以SW 和SW-OVA 作为包被抗原的检测结果比较
• 4.2 结果
• 4.2.1 酶标抗体最适稀释度的确定
• 4.2.2 包被抗原SW-OVA 最适浓度以及封闭剂的确定
• 4.2.3 ELISA 检测小鼠血清的重复性试验结果
• 4.2.4 以SW 和SW-OVA 作为间接ELISA 包被抗原的结果比较
• 4.3 讨论
• 4.3.1 SW-BSA 人工抗原的免疫效果
• 4.3.2 抗SW 抗体的检测
• 4.3.3 包被抗原的选择
• 小结
• 第五章 SW-BSA 免疫原性的鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 主要试剂与器材
• 5.1.3 小鼠免疫试验
• 5.1.4 家兔免疫试验
• 5.1.5 血清抗体效价的测定
• 5.1.6 家兔血清抗体的琼脂扩散试验
• 5.2 结果
• 5.2.1 小鼠免疫试验结果
• 5.2.2 家兔免疫试验结果
• 5.2.3 琼脂扩散试验结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 SW-BSA 的免疫原性
• 5.3.2 SW-BSA 刺激机体产生抗体的针对性
• 小结
• 结论
• 进一步研究的课题
• 参考文献
• 附录Ⅰ谱图
• 附录Ⅱ英汉对照
• 附录Ⅲ ELISA 相关缓冲液和佐剂的配制
• 附录Ⅳ试验用生物碱显色剂配制
• 致谢
• 作者简介