水稻基因OsRwp34的克隆及其表达产物对大肠杆菌的毒害作用

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是我国乃至世界最重要的粮食作物之一,水稻的稳定高产是我国粮食安全的重要保障。然而,水稻生长期间经常遭受自然界中多种逆境胁迫伤害,每年由于自然灾害的原因造成水稻大量减产,并严重影响水稻的品质。而温度是水稻生长的一个关键的环境因子,我国水稻栽培范围广、种植面积大,由于温度过低或过高的不良影响,常常造成水稻大面积减产。 长江流域水稻生长期间常常会遇到高温热害。水稻抽穗扬花期遭受高温胁迫会导致结实率明显下降和严重减产。针对水稻生产的高温热害问题,本研究采用幼苗期高温胁迫处理,构建高温诱导的cDNA文库,并进一步分离和鉴定高温诱导差异表达基因,为在分子水平上研究高温胁迫对水稻育性转换机理创建技术平台。获得的主要研究结果如下: 1.我们用9311作为材料,9311的3叶期幼苗在45℃高温下处理2小时,提取总RNA,使用CLONTECH公司的SMARTTM cDNA Library Construction Kit成功构建了水稻高温诱导的cDNA文库。cDNA文库滴度115000000pfu/mL,平均长度为800bp。 2.通过测序,在水稻高温诱导cDNA文库中发现一个新的水稻基因OsRwp34。cDNA全长659bp,包含378bp的ORF,编码一个125个氨基酸的多肽。用BLASTP分析蛋白的结构和同源性,发现它没有保守的功能结构域,不属于任何一个基因家族和基因超家族,为一典型孤儿基因。HMMTOP分析发现OsRwp34C端94-113氨基酸组成一个跨膜的疏水性螺旋结构,N端位于细胞基质,用PSORTⅡ分析OsRwp34蛋白定位于内质网的概率为66.7%。OsRwp34在Oryza sativa nipponbare（G3）中为单拷贝,定位于第9号染色体68.2cM处,而Southem blot结果说明OsRwp34在水稻品种9311基因组中有3个拷贝。Northern blot表明,OsRwp34在水稻不同品种中的存在

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 图位克隆
• 2 差异表达基因（片段）的获得
• 2.1 扩增限制性片段长度多态性
• 2.2 差异显示PCR
• 2.3 RNA指纹技术
• 2.4 差减杂交与抑制性差减杂交
• 2.5 cDNA代表性差异分析
• 2.6 表达序列标签
• 2.7 序列基因表达测定
• 2.8 DNA芯片分析
• 2.9 全长的cDNA测序
• 3 基因功能的研究
• 3.1 计算机预测基因功能
• 3.2 实验确认基因功能
• 3.2.1 基因失活是功能分析的主要手段
• 3.2.1.1 基因敲除
• 3.2.1.2 突变库构建
• 3.2.1.3 反义RNA
• 3.2.1.4 RNAi
• 3.2.1.5 内含子归巢突变
• 3.2.2 基因的超表达用于功能检测
• 3.2.3 基因捕捉
• 3.2.4 激活标签方法
• 3.2.5 噬菌体展示
• 3.2.6 酵母双杂交
• 3.2.7 蛋白质组
• 4 本研究的内容、目的
• 第二章 水稻高温胁迫的cDNA文库的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 材料的培养和处理
• 1.3 总RNA提取
• 1.4 构建cDNA文库
• 1.4.1 合成第一链
• 1.4.2 LD-PCR扩增cDNA合成第二链
• 1.4.3 蛋白酶K消化
• 1.4.4 Sfi I酶切
• TM-400分子筛柱'>1.4.5 酶切产物通过CHROMA SPIN^TM-400分子筛柱
• 1.4.6 连接
• 1.4.7 细菌培养物的复苏和准备
• 1.4.8 cDNA文库的包装
• 1.4.9 滴度测定
• 1.4.10 计算文库的重组率
• 1.4.11 计算文库cDNA片段的平均长度
• 1.4.12 文库的扩增
• 1.4.13 噬菌体文库（TriplEx）转化为质粒文库（pTriplEx）
• 1.4.14 测序
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 LD-PCR合成的ds cDNA
• 2.3 过柱收集＞500bp的ds cDNA
• 2.4 未扩增的文库滴度测定
• 2.5 计算文库的重组率
• 2.6 cDNA文库平均长度
• 2.7 测序结果
• 3 讨论
• 第三章 OsRwp34的克隆及其功能的初步分析
• 1 材料和方法
• 1.1 序列分析
• 1.2 Southern杂交
• 1.2.1 水稻总DNA的抽提
• 1.2.2 水稻总DNA限制性酶切和电泳
• 1.2.3 转膜
• 1.2.4 探针的制备
• 1.2.5 杂交和洗膜
• 1.2.6 放射自显影
• 1.2.7 X光胶片的冲洗
• 1.2.8 从杂交膜上除去探针
• 1.3 Northern杂交
• 1.3.1 材料及处理
• 1.3.2 RNA抽提
• 1.3.3 甲醛／琼脂糖凝胶电泳
• 1.3.4 转膜
• 1.3.5 探针的制备
• 1.3.6 杂交和洗膜
• 1.3.7 放射自显影和胶片的冲洗
• 1.4 OsRwp34的融合表达重组质粒的构建
• 1.4.1 插入片段的准备
• 1.4.2 质粒的准备
• 1.4.3 连接
• 1.4.4 转化
• 1.4.5 PCR筛选阳性菌落
• 1.4.6 酶切鉴定及测序鉴定
• 1.4.7 重组质粒转化E Coli菌株BL21（DE3）
• 1.4.8 诱导表达和检测
• 1.5 缺失体的构建、诱导表达和检测
• 1.5.1 PCR引物设计
• 1.5.2 缺失体的构建和筛选
• 1.5.3 诱导表达和检测
• 2 结果与分析
• 2.1 OsRwp34 cDNA片段的分离和测序
• 2.2 OsRwp34的同源性分析
• 2.3 OsRwp34水稻染色体中的定位
• 2.4 Southern blot分析
• 2.5 OsRwp34蛋白性质预测
• 2.6 OsRwp34在水稻不同品种中的存在表达差异
• 2.7 pET（28a）OsRwp34表达载体的构建
• 2.8 OsRwp34的表达产物对大肠杆菌具有毒性作用
• 2.9 OsRwp34缺失体分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 硕士在读期间发表和待发表的论文:
• 致谢