胃癌功能性单克隆抗体的研究

论文摘要

胃癌是世界和我国均最常见的恶性肿瘤之一,由于缺少有效的治疗药物,胃癌目前5年生存率还很低。随着肿瘤靶向治疗的兴起,寻找在胃癌生长转移过程中发挥着重要功能的特异的基因/蛋白,为靶向治疗胃癌提供有价值的靶标已成为胃癌研究的新热点。本研究采用“功能性单克隆抗体库技术”,通过建立大容量抗胃癌细胞单抗库并进行直接的体内外功能性筛选,以期筛选出胃癌增殖转移相关功能性单抗,为分离获得具有作为胃癌治疗靶标潜力的相应靶抗原功能性基因/蛋白奠定基础。采用固定化的人胃癌细胞NCI-N87免疫BALB/c小鼠,甲基纤维素选择培养技术制备杂交瘤单抗库。用活细胞免疫荧光筛选能与胃癌细胞反应的单抗,正常胃组织标本免疫组化负筛选与正常胃组织交叉反应的单抗。然后以直接的抑制人胃癌细胞增殖、黏附、迁移、侵袭的功能性实验从单抗库中筛选具有抑制作用的功能性单抗,并采用共接种动物模型对部分功能性单抗进行体内抑制移植瘤生长作用的筛选。纯化部分所获得的功能性单抗,进一步确定其体内外抑制胃癌生长的作用及量效关系。采用细胞免疫荧光及免疫组化对部分确定有功能的抗体所识别的抗原蛋白进行亚细胞定位及组织表达特异性的初步研究,并采用WesternBlotting分析其识别的抗原蛋白的分子量。取1只免疫小鼠的脾细胞融合,成功制备了含有1012株杂交瘤克隆的大容量单抗库,免疫荧光筛选得到了295株可与活的人胃癌细胞反应的单抗,其中252株显示出膜反应特征。经免疫组化筛选获得与正常胃癌组织不反应或低反应、具有相对特异性的单抗145株。以直接的功能性筛选实验从这145株单抗中筛选出能显著抑制人胃癌细胞增殖的单抗22株,抑制率为16%～44%;能显著抑制人胃癌细胞与淋巴内皮粘附的单抗4株,抑制率达15～33%;能显著抑制胃癌细胞迁移的单抗9株,抑制率为15-34%;能显著抑制胃癌细胞侵袭的单抗1株,抑制率为28%。挑选部分抑制胃癌增殖的功能性单抗共计8株在裸鼠体内采用共接种模型进行体内抑瘤作用的筛选,结果显示其中4株单抗能够非常显著地抑制移植瘤的生长,抑制率达58%～69%。采用纯化的单抗证明,这4株中的11G5单抗体外对人胃癌细胞增殖的抑制作用呈现一定的量效依赖关系,体内抑瘤实验中高（50mg/（kg·次））、中（25mg/（kg·次））、低（12.5mg/（kg·次））治疗组对移植瘤的抑制率分别为75.73%、65.29%、53.77%,也具有一定的量效依赖关系。活细胞免疫荧光结果显示11G5抗原定位在胃癌细胞膜上,初步的免疫组化研究表明11G5的靶抗原在胃癌组织中的表达显著高于胃正常组织。Western Blotting分析表明其识别的为空间表位。本研究首次制备成功了含1012个克隆的抗胃癌大容量单抗库,从中筛选获得了32株能够抑制人胃癌细胞增殖、黏附、迁移、侵袭的功能性单抗,其中4株在体内也能够显著抑制人胃癌生长的抗胃癌功能性抗体,为分离鉴定在胃癌生长转移中发挥着重要作用的功能性基因/蛋白奠定了基础。本研究确证了其中1株单抗11G5具有体内外抑制胃癌生长的作用,并初步证明其定位于细胞膜上,在人胃癌组织中较特异地表达,提示11G5单抗所识别的功能性抗原蛋白可作为胃癌靶向治疗的潜在靶标。本研究同时还初步验证了所采用的“功能性单克隆抗体库技术”分离鉴定胃癌生长转移相关的功能性基因/蛋白有效、可行,有望为肿瘤靶向治疗分子靶标的筛选分离提供一个新的有效工具。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 附录一 参加会议
• 附录二 发表文章