白桦低温胁迫响应与叶绿体RNA结合蛋白的蛋白质组学研究

论文摘要

低温是植物最主要的非生物胁迫因子之一,影响很多重要经济植物的生长和地理分布。白桦是世界重要的经济植物,而且具有较强的抗寒性。利用蛋白质组学方法研究白桦对低温胁迫的应答机制,发掘耐寒基因和低温应答相关蛋白,对于全面揭示抗寒植物低温适应的遗传基础,揭示其抗寒机理具有重要的意义。将白桦幼苗分别置于4℃和对照（23℃）的人工气候室中,在处理当天、4d、7d、10d、14d时测定其高生长量、叶片质膜透性、叶绿素相对含量、叶绿素荧光参数PSⅡ有效光化学量子产量（Fv′/Fm′）、光化学淬灭效率（qp）、非光化学猝灭系数（NPQ）和可溶性糖含量的变化情况。结果表明:低温胁迫导致高生长基本停止,叶绿素含量逐渐降低,14d时叶片变黄;相对电导率先升高后降低,最后恢复到对照水平;Fv′/Fm′、qp和NPQ与对照相比均显著降低,Fv′/Fm′和NPQ则表现为先降低后有升高,最后降低的波动形式,可溶性糖含量明显提高。这些现象表明,4℃低温已造成了质膜可逆性的伤害和PSⅡ原初光能转化受到抑制,但随着胁迫时间延长,植物产生了适应性,抗寒能力得到了显著提高。用2 DE-GEL方法分析了白桦幼苗在4℃处理当天、4d和14d时的蛋白质图谱,在凝胶图上检测到37个丰度发生2倍以上变化的差异蛋白点,其中15个高丰度的差异蛋白点用ESI-MS/MS成功地得到了鉴定。鉴定的蛋白质通过Swiss Prot/rEMBL数据库检索和分析以及相关的文献报道对其功能进行了分类,大致分成4类,即参与信号转导、光合作用,碳、氮及能量代谢和应激相关蛋白。分析鉴定的蛋白质有50%以上定位于叶绿体上,表明叶绿体可能在植物应答低温胁迫机制中具有重要的作用。叶绿体RNA结合蛋白是调控叶绿体基因表达的重要因素。通过层析柱分离了白桦叶绿体蛋白中与多聚腺苷酸和ssDNA紧密结合的RNA结合蛋白。然后使用双向电泳技术分离这些蛋白,通过MALDI-TOF-MS和ESI-MS-MS分析图谱上的主要蛋白质点,成功地鉴定了13个蛋白质。鉴定的蛋白多数在Swiss-prot/TrEMBL数据库中定义了功能,其中4个已报道具有RNA结合蛋白的性质;3个具有ATP结合特性;1个具有NAD结合特性;1个具有DNA结合特性;4个蛋白没有外观的结合性质;用这种方法浓缩和鉴定了4个丰度蛋白,包括1个转录因子。此研究加深了对树木中叶绿体RNA结合蛋白功能的全面理解,也表明可以在其他植物叶绿体中开展RNA和蛋白质相互作用的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 1.1 植物抗寒性研究进展
• 1.1.1 植物在低温胁迫下的生理反应机制
• 1.1.2 植物在低温胁迫下的分子反应机制
• 1.1.3 白桦低温胁迫生理及分子反应机制
• 1.2 蛋白质组学研究进展
• 1.2.1 蛋白质组学研究概况
• 1.2.2 当前蛋白质组的研究策略与范围
• 1.2.3 相关蛋白质组学技术进步
• 1.2.4 生物信息学技术
• 1.2.5 低温胁迫蛋白质组学
• 1.2.6 叶绿体蛋白质组学
• 1.2.7 叶绿体RNA结合的蛋白蛋白质组学
• 1.3 立题的依据和意义
• 2 低温胁迫对白桦生长和生理的影响
• 2.1 研究方法
• 2.1.1 苗高生长量的测定
• 2.1.2 质膜透性的测定
• 2.1.3 叶绿素含量的测定
• 2.1.4 叶绿素荧光特性的测定
• 2.1.5 可溶性糖含量的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 低温胁迫对白桦幼苗生长的影响
• 2.2.2 低温胁迫对叶片细胞质膜相对透性（PMP）的影响
• 2.2.3 低温胁迫对叶绿素相对含量的影响
• 2.2.4 低温胁迫对叶绿素荧光参数（Fv'/Fm'）的影响
• p）的影响'>2.2.5 低温胁迫对光化学淬灭系数（q_p）的影响
• 2.2.6 低温胁迫对非光化学猝灭系数（NPQ）的影响
• 2.2.7 低温胁迫下PMP变化与叶绿素荧光参数Fv'/Fm'和NPQ变化的相关性分析
• 2.2.8 低温胁迫对白桦叶片可溶性糖含量的影响
• 2.3 结论与讨论
• 2.4 本章小结
• 3 白桦叶片全蛋白双向电泳体系的建立
• 3.1 研究方法
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.1.3 研究方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 结论
• 3.4 讨论
• 3.4.1 蛋白样品的制备
• 3.4.2 电泳的条件
• 3.4.3 提高双向电泳检测蛋白范围的措施
• 3.5 本章小结
• 4 白桦叶片低温胁迫下蛋白质组学研究
• 4.1 研究方法
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 主要实验仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 叶片总蛋白低温胁迫下的双向电泳分析
• 4.2.2 低温胁迫下差异蛋白的质谱鉴定
• 4.2.3 蛋白质定位
• 4.3 讨论
• 4.3.1 白桦低温胁迫的差异蛋白质双向电泳
• 4.3.2 低温诱导蛋白与植物抗寒性的关系
• 4.3.3 白桦抗寒分子机制和生理机制初步分析
• 4.4 本章小结
• 5 白桦叶绿体RNA结合蛋白的蛋白质组学研究
• 5.1 研究方法
• 5.1.1 白桦材料的培养
• 5.1.2 叶绿体的分离
• 5.1.3 叶绿体蛋白的提取
• 5.1.4 叶绿体RNA结合蛋白亲和层析分离
• 5.1.5 polyA结合蛋白的亲和层析分离
• 5.1.6 RNA结合蛋白和Poly-A结合蛋白的纯化
• 5.1.7 蛋白质双向电泳
• 5.1.8 考马斯亮蓝染色
• 5.1.9 凝胶扫描和图像分析
• 5.1.10 蛋白质胶内酶解
• 5.1.11 质谱分析以及数据库检索
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 蛋白质的质谱鉴定
• 5.2.2 蛋白质的功能分析
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢