基于免疫传感技术的BSP和HBsAg检测方法的初步研究

论文摘要

通过生物传感技术检测疾病标志物,进行临床疾病的准确、快速诊断以及流行病的现场筛选与群体监控,是当前检验医学的热点研究课题。免疫传感技术结合了生物传感技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性,在临床生化免疫检验方面显示出诱人的应用前景。本文基于实验室先前的工作,结合纳米技术、毛细管电泳技术和流动注射技术,以此构建了基于免疫传感技术的人血清骨唾液蛋白（bone sialoprotein,BSP）和乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）检测方法,具体内容如下:（1）基于纳米压电传感技术的BSP免疫检测方法的研究BSP是细胞外基质中的一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,其血清含量的检测在评估肿瘤骨转移和骨代谢水平方面具有重要的临床检测价值。本实验以AT切型、10 MHz双面镀金的石英晶体为换能器,制作一种四通道纳米压电免疫传感器阵列,用于检测临床血清中BSP的含量。将纳米金颗粒（Au nanopaticles,AuNPs）通过1,6-己二硫醇固定在金电极表面。采用巯基化试剂Sulfo-LC-SPDP将鼠抗人BSP单克隆抗体巯基化,并将其固定于修饰有AuNPs的石英晶体金电极表面,通过免疫反应检测血清中BSP的含量。AuNPs较高的比表面积使其承载更多的抗体,同时可较好地保持抗体的反应活性,以其为载体制备的传感器具有更大的频率响应值。实验研制的BSP纳米压电免疫传感器阵列在血清稀释度为1:9～1:2的范围内,呈较好的线性关系,回归方程为?F = 872.66c-58.258（相关系数为0.9737）,具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、特异性好等优点,可实现血清BSP的定量检测。（2）基于毛细管电泳电化学传感技术的HBsAg免疫检测方法的研究HBsAg是人体感染乙型肝炎病毒重要的血清学标志物。在乙肝病毒感染的人群中,有相当比例的患者HBsAg的含量呈低水平状态,提高HBsAg检测的灵敏度有很重要的意义。实验以微量滴定板为固相载体,预包被上乙肝表面抗体,与血清HBsAg及活化钌标记的乙肝表面抗体之间发生特异性免疫反应,形成三明治结构,将此双抗夹心免疫复合物进行毛细管电泳电化学分析。利用此毛细管电泳电化学免疫检测方法测定人血清HBsAg含量,浓度在0.08～10 ng/mL范围内与峰电流呈良好的线性关系,线性回归方程为y = 0.2840x + 0.9535（相关系数为0.9857）,检出限为0.01 ng/mL （3 ）,可以实现低浓度HBsAg血清样本低廉、快速、简便、定量检测。（3）基于流动注射技术的电化学发光分析体系的研究本研究构建了一种流动注射电化学发光分析系统,为临床多肿瘤标志物的联合检测作前期研究。实验采用流动注射法进样,用循环伏安法进行电化学分析,通过化学发光图谱考察所建立体系的响应特性。结果发现这种基于流动注射分析技术的电化学发光分析体系在Ru（bpy）32+浓度为5×10-8～5×10-5 mol/L的范围内呈良好的线性关系,其回归方程为y = 1.3409 x– 77.79（相关系数为0.9985）,灵敏度达到5×10-8 mol/L（3 ）,具有一定的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物传感技术
• 1.1.1 生物传感器的概述
• 1.1.2 压电生物传感技术
• 1.1.3 电化学生物传感技术
• 1.1.4 电化学发光生物传感技术
• 1.3 免疫检测方法
• 1.3.1 酶联免疫分析法
• 1.3.2 放射免疫分析法
• 1.3.3 荧光免疫分析法
• 1.3.4 时间分辨荧光免疫分析法
• 1.3.5 电化学发光免疫分析
• 1.4 本课题研究背景及研究意义
• 1.4.1 基于纳米压电传感技术的骨唾液蛋白免疫检测方法的研究背景及意义
• 1.4.2 基于毛细管电泳电化学传感技术的人血清乙肝表面抗原免疫检测方法的研究背景及意义
• 1.4.3 基于流动注射技术的电化学发光分析体系的研究背景及意义
• 1.5 本研究论文的构想
• 1.5.1 基于纳米压电传感技术的骨唾液蛋白免疫检测方法的研究
• 1.5.2 基于毛细管电泳电化学传感技术的人血清乙肝表面抗原免疫检测方法的研究
• 1.5.3 基于流动注射技术的电化学发光分析体系的研究
• 第二章 基于压电传感技术的骨唾液蛋白免疫检测方法的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 血清标本
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 相关溶液的配置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 阵列的设计与制备
• 2.3.2 石英晶体金电极阵列清洗装置的设计及金电极表面的预处理
• 2.3.3 抗体的固定
• 2.3.4 临床血清检测
• 2.3.5 统计学分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 纳米金颗粒性质鉴定及经纳米金修饰的石英晶体金电极表征
• 2.4.2 抗体固定浓度的选择
• 2.4.3 两种固定方法的比较
• 2.4.4 压电免疫传感器阵列的响应特性
• 2.4.5 临床血清检测
• 2.5 小结
• 第三章 基于毛细管电泳电化学传感技术的人血清乙肝表面抗原免疫检测方法的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 乙肝表面抗体的标记
• 3.3.2 免疫反应
• 3.3.3 电化学测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 活化钌标记的乙肝表面抗体浓度的选择
• 3.4.2 双抗夹心免疫复合物的循环伏安扫描
• 3.4.3 分离电压的选择
• 3.4.4 NaOH 浓度和解析时间的选择
• 3.4.5 线性范围及检出限
• 3.5 小结
• 第四章 基于流动注射技术的电化学发光分析体系的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 溶液的配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 工作电极的制备
• 4.3.2 实验方法及条件
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 工作电位的选择
• 4.4.2 载流流速和进样量的选择
• 4.4.3 pH 的影响
• 4.4.4 线性范围和检测限
• 4.5 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢